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    檳榔種苗和采摘工具的植原體檢測

    2022-02-03 02:49:32林兆威宋薇薇唐慶華牛曉慶王宇航孟秀利
    熱帶農(nóng)業(yè)科學 2022年11期
    關鍵詞:黃化病原體檳榔

    林兆威 宋薇薇 唐慶華 牛曉慶 王宇航,2 孟秀利

    (1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所/海南省院士團隊創(chuàng)新中心/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心 海南文昌571339;2. 海南大學植物保護學院 海南???570228)

    檳榔(Areca cathecuL.)是棕櫚科檳榔屬多年生熱帶作物,也是中國的“四大南藥”(檳榔、砂仁、益智及巴戟天)之首。在我國,檳榔主要栽培于海南省、臺灣省及云南省等地,其中海南省檳榔種植面積占全國的95%以上,產(chǎn)量位居世界第二位[1]。目前,檳榔作為海南省重要的熱帶經(jīng)濟作物,是省政府重點發(fā)展的“六棵樹”(橡膠、椰子、檳榔、沉香、花梨及油茶)之一、省中東部地區(qū)230萬農(nóng)民經(jīng)濟收入的主要來源及省中部貧困地區(qū)脫貧的重要支柱產(chǎn)業(yè)[2]。由于當前檳榔經(jīng)濟效益的增長,種植面積不斷增加,檳榔病蟲害問題日益嚴重。其中,由植原體(Phytoplasma)侵染引起的檳榔黃化?。ˋreca palm yellow leaf disease, AYLD)是當前嚴重危害檳榔的致死系統(tǒng)性病害之一,可造成檳榔產(chǎn)量急劇下降;該病于1981年首次出現(xiàn)在我國海南省屯昌縣[3],目前在全省絕大部分的檳榔種植區(qū)發(fā)生為害[4-5]。據(jù)不完全統(tǒng)計,每年因黃化病為害所造成的經(jīng)濟損失達20億元以上,嚴重影響海南省農(nóng)民脫貧致富和農(nóng)村經(jīng)濟增長[6]。因此,檳榔黃化病的防控是當前迫切需要解決的產(chǎn)業(yè)問題。

    阻斷由人為因素介導的植物病害傳播途徑是防控的關鍵手段之一,而人為因素介導的傳播方式有感病種苗調(diào)動[7]、人工嫁接傳播[8-9]及摩擦創(chuàng)傷傳播[10]等。然而,在檳榔黃化病方面,攜帶植原體的檳榔種果出苗后植株是否仍存在植原體,且采摘工具在感病檳榔上采果后,金屬表面殘留汁液是否攜帶植原體,目前尚未證實。因此,本研究采用熒光定量PCR技術,待攜帶植原體的檳榔種果出苗后對其根、假莖及葉進行植原體檢測,并對苗圃幼苗及采摘工具表面進行植原體檢測,初步明確檳榔黃化病種果種苗的傳播及其采摘工具的帶毒情況,為檳榔黃化病的防控提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 供試檳榔果(9個)采自儋州市蘭洋鎮(zhèn)田間表現(xiàn)黃化病癥狀的檳榔成熟果實;苗圃幼苗葉片樣品分別采自澄邁縣加樂鎮(zhèn)(10份)、定安縣嶺口鎮(zhèn)東升農(nóng)場(10份)及文昌市南陽鎮(zhèn)南陽農(nóng)場(10份),幼苗為12月齡,苗圃均為在售狀態(tài)且幼苗無癥狀;5年生感染植原體且?guī)в谢ò臋壚疲?株),種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所基地的隔離網(wǎng)室;檳榔采摘使用的割刀1把。

    1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑:植物基因組DNA提取試劑盒、高效口腔拭子基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR mix及實時熒光定量PCR試劑盒購于天根生物科技(北京)有限公司。主要儀器:5810R離心機、1~1 000 μL移液器、GD120恒溫水浴鍋及QuantStudio3 Real-time定量PCR儀等。

    1.2 方法

    1.2.1 檳榔病果出芽后植原體檢測 參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書,進行檳榔種果內(nèi)皮DNA提取,參照孟秀利等[11]的檳榔黃化植原體巢氏PCR檢測方法進行植原體檢測,將PCR擴增結(jié)果送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序;將植原體呈陽性的種果種植于花盆(土壤已121℃滅菌20 min),并置于高密度隔離網(wǎng)(200目)中,室內(nèi)日常栽培管理;待出苗且幼苗長出兩片葉后,參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書對幼苗葉片、假莖及根進行DNA提取;使用熒光定量PCR檢測方法(熒光定量PCR引物探針組合另作發(fā)表),參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書,反應體系(20 μL):2×SuperReal PreMix(Probe)10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL,熒光探針(10 μmol/L)0.4 μL,DNA模板2 μL,50×ROX Reference Dye3 0.2 μL,RNase-Free ddH2O 6.2 μL。實時熒光定量PCR反應程序參照說明書:95℃預變性 15 min;95℃變性3 s,60℃退火/延伸30 s,45個循環(huán)。健康樣品為陰性對照,無菌水為空白對照,每株苗重復檢測3次。

    1.2.2 苗圃檳榔幼苗的植原體檢測 參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書,進行苗圃檳榔幼苗葉片的DNA提取,參照1.2.1方法中的熒光定量PCR檢測方法進行植原體檢測。健康樣品為陰性對照,無菌水為空白對照,每份樣品重復檢測3次。

    1.2.3 檳榔采摘工具表面殘留汁液的植原體檢測模擬田間采果的方式,在花苞柄處用割刀割5次,使用脫脂棉擦拭割刀上的汁液,將脫脂棉置于2 mL離心管內(nèi),參照高效口腔拭子基因組DNA提取試劑盒說明書,提取割刀上殘留檳榔汁液的DNA,共模擬采果3次;參照1.2.1中的熒光定量PCR檢測方法進行植原體檢測,健康樣品為陰性對照,無菌水為空白對照,每份樣品重復3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 檳榔種果種苗植原體檢測

    在種植前對9個檳榔種果進行巢氏PCR植原體檢測,僅4份種果表現(xiàn)植原體陽性(圖1),分別為4、5、7、及9號種果,擴增結(jié)果測序比對均為植原體。將陽性的種果種植于無菌土并置于高密度隔離網(wǎng)中,其中3份種果出芽,即4、5及9號種果,待成苗長出兩片葉后,采用熒光定量PCR技術對幼苗葉、假莖及根進行植原體檢測,如圖2~4所示,3份幼苗葉、假莖及根均檢測出植原體陽性,健康和空白對照未檢測出植原體。由此表明,攜帶植原體的檳榔種果出苗后,植原體在植株體內(nèi)呈系統(tǒng)性擴散。

    圖1 檳榔種果種植前巢氏PCR植原體檢測

    圖2 檳榔種果出苗后葉片熒光定量PCR植原體檢測

    圖3 檳榔種果出苗后假莖熒光定量PCR植原體檢測

    圖4 檳榔種果出苗后根部熒光定量PCR植原體檢測

    2.2 苗圃幼苗的植原體檢測

    使用熒光定量PCR檢測技術,對3個苗圃隨機采集的30份幼苗樣品進行植原體檢測,如表1所示,30份苗圃幼苗有8份檢測為植原體陽性。結(jié)果表明,苗圃中有部分的幼苗攜帶植原體,現(xiàn)市場上出售的幼苗存在檳榔黃化病擴散的風險。

    表1 苗圃幼苗的植原體檢測結(jié)果

    2.3 采摘工具表面的植原體檢測

    通過模擬采果的方式,使用采摘工具對感染植原體檳榔花苞短柄進行切割,對采摘工具表面所殘留的檳榔汁液進行植原體檢測,如圖5所示,3份樣品均檢測出植原體陽性,健康和空白對照未檢測出植原體,表明利用采摘工具對感病植株進行采果后,金屬表面仍存在植原體,其殘留的感病檳榔汁液可能增加檳榔黃化病傳播的風險。

    圖5 采摘工具表面殘留汁液的熒光定量PCR植原體檢測

    3 討論

    關于種傳病害的研究,在植物病毒方面,瓠瓜感染黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)后,子一代150粒種子中傳毒率為84%,子二代種傳率為2%[12]。梁智玲等[13]使用收獲的攜帶小西葫蘆綠斑駁花葉病毒(Zucchini green mottle mosaic virus,ZGMMV)的葫蘆、西瓜和甜瓜種子,室溫放置10個月后播種仍具有傳毒能力,種傳率為1%。在植原體病害方面,無性繁殖材料和有性繁殖材料均可傳播植原體[14]。前人研究發(fā)現(xiàn),云南省臨滄市的甘蔗白葉?。⊿ugarcane white leaf, SCWL)主要由蔗種傳播,5個品種的平均病株率11.7%~27.7%、宿根平均病株率23.6%~72.9%[15];由于大部分蔗農(nóng)忽視甘蔗種莖質(zhì)量的重要性,缺乏對帶毒種莖危害的認識,導致白葉病疫情難以防控[16]。在本研究中,3顆經(jīng)鑒定的帶毒種果在隔離情況下種植,從3株幼苗的根、假莖及葉中均檢測到植原體,說明檳榔黃化病植原體可隨種果出苗,在植株體內(nèi)呈系統(tǒng)性分布,對于種果、種苗持續(xù)帶毒時間及種苗是否可多代傳播,將作進一步驗證。另外,本研究在3個不同市縣苗圃共采集的30份樣品存在部分幼苗攜帶植原體,因此,帶毒種苗調(diào)運將增加檳榔黃化病的傳播風險。在機械傳播方面,Coutts等[17]研究發(fā)現(xiàn),小西葫蘆黃花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)可通過污染的刀片傳播;大多數(shù)植物細菌性病害也可通過刀口創(chuàng)傷傳播[18]。目前關于植原體機械傳播的報道較少,本研究在采摘工具表面殘留的檳榔汁液中檢測到植原體,關于采摘工具是否會對檳榔產(chǎn)生交叉感染、需要多少含量植原體才能感染,將作進一步研究。

    檳榔黃化病是一種毀滅性病害,類似的植物毀滅性病害防控之鑒,如柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing,HLB),前人提出,“三板斧”措施中,應用無病種苗是當前有效的防控技術措施之一[19]。目前針對檳榔黃化病的防治尚未有特效藥,前人提出了“一養(yǎng)、二誘、三調(diào)、四治、五除”的檳榔黃化“五板斧”防控措施[20]。因此,就本研究結(jié)果提出相關建議:(1)制定嚴格的種苗生產(chǎn)許可審批制度,對種子來源嚴格管控,嚴禁使用疫區(qū)種果育苗,母株定期檢測,確保種子來源健康;(2)合理布局育苗圃,嚴禁在發(fā)病區(qū)設立育苗圃,做好育苗圃的病害防控設施,如防蟲網(wǎng)隔離;(3)定期對種苗進行黃化病抽樣檢測,尤其在出苗前要抽樣檢測,避免苗期無癥狀導致帶毒幼苗流入檳榔園;(4)加大宣傳對采摘工具的消毒處理,提高果農(nóng)對檳榔黃化病的防范意識;(5)加大科研投入,鼓勵相關的科研單位和企業(yè)參與檳榔種質(zhì)資源的收集、選育工作,采用雜交育種、分子標記輔助育種及基因編輯技術等加快抗、耐病品種的選育進度,確保檳榔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

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