油茶生殖生物學及雜交育種研究進展

于釗妍 劉艷菊 徐玉芬 賈效成

（中國熱帶農業(yè)科學院椰子研究所 海南文昌 571339）

油茶（Camelliaspp.）是山茶屬（Camellia）植物中種子含油率較高樹種的統(tǒng)稱，是我國重要的食用油料樹種之一，被譽為“東方油橄欖”，與油棕（Elaeis quineensis）、油橄欖（Olea europaea）、椰子（Cocos nucifera）并稱為世界四大木本油料樹種[1]。我國現有油茶種植面積7 000萬畝（1畝≈667 m2），以普通油茶（Camellia oleiferaAbel.）為主，其余具有一定栽培面積的油茶物種包括：小果油茶（C. meiocarpaHu.）、越南油茶（C.vietnamensisHuang.）、攸縣油茶（C. yuhsienensisHu.）、浙江紅山茶（C. chekiangoleosaHu.）等[2]。

生殖過程是生物延續(xù)的重要生命現象，與遺傳、進化、乃至生命起源等密切關聯[3]。油茶具有“抱子懷胎”的特點，落花落果現象嚴重，進行生殖生物學研究不僅有利于掌握其開花規(guī)律，提高產量，且有利于選擇優(yōu)良的雜交親本，對新品種選育、品種配置方案制定與品種改良的開展產生積極的指導意義[4]。20世紀80年代以來，隨著生殖生物學理論和實驗手段的不斷發(fā)展，有關油茶生殖生物學的研究在有性生殖過程、雜交育種以及生殖工程等方面取得了一定的進展。本文對油茶開花物候、傳粉、受精、果實發(fā)育等生殖生物學特性及油茶雜交育種進展進行歸納總結，以期為今后相關研究工作提供參考。

1 油茶開花生物學研究

1.1 開花物候

油茶生命周期長，從花芽分化至果實生長發(fā)育歷時一年之久，在果實成熟過程中落花落果現象嚴重，因此在生產中一直存在花多果少、坐果率低的現象。油茶這一特性，民間又稱為“抱子懷胎”，由于其秋花秋實，通常果實成熟不久，下年的花期又到，這是油茶植物異于其它果樹的一大特征[5]。遺傳因子和氣候因子是影響花期的重要因素，前者主要決定花期的類型，后者決定花期“入秋”早遲，進而影響次年產量。

普通油茶通常于5—6月初開始花芽分化，10月中下旬開花，11月為盛花期，花期一般有2～3個月[6-7]。油茶花期長短受品種、年份的影響而不同，當時氣溫和空氣濕度也直接影響油茶開花周期和長短，高州油茶5月中旬至10月進行花芽分化，11月上旬開花；騰沖紅花油茶（C. reticulataLindl.）則在翌年1月進入初花期，其中2019年比2018年進入初花期的時間更早[8-9]。氣溫低、空氣濕度高，開花時間延長；反之則縮短。

1.2 花芽分化

營養(yǎng)生長減弱時，生殖作用才會發(fā)生，但是也需要一定的營養(yǎng)生長作為基礎，因此油茶的花芽分化通常發(fā)生在春梢基本結束生長后。油茶花芽沒有固定的著生模式，既存在單花芽，又存在混合花芽，既存在頂花芽，又存在腋花芽。

不同油茶種類花芽分化時間有所不同，且易受到光照和溫度的影響。普通油茶花芽分化從5月上旬至9月中旬，長瓣短柱油茶（C. yuhsienensisHu.）花芽分化過程時間比普通油茶短7 d；廣寧紅花油茶（C. semiserrataChi.）4月下旬開始花芽分化，至9月下旬完成；高州油茶分化時期為5月中旬至10月中旬，花芽含水率經歷下降、上升、下降的過程，養(yǎng)分含量變化較大，觀察中發(fā)現，高州花芽分化是分批進行的，各單株花芽分化時間有差異[10-12]。袁德義[13]運用石蠟切片的方法，觀察發(fā)現‘湘林1號’油茶花芽形態(tài)分化可分為前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房與花藥形成期、雌雄蕊成熟期6個時期?？梢娀ㄑ糠只谟筒栝_花過程中起到至關重要的作用，直接影響開花的數量和質量，而開花數量直接影響坐果率[14-15]。

2 傳粉生物學研究

2.1 花粉特性

花粉的形態(tài)特征受外界環(huán)境影響較小，主要由基因控制，因此具有很強的遺傳穩(wěn)定性。油茶花粉顏色為黃色或淡黃色，花粉形態(tài)多樣，呈現橢圓形、三裂圓形及圓形等，多數花粉屬于中等大小。不同油茶品種的花粉量存在一定的差異，不同品種的花粉形狀也有一定的差異，其形狀接近球形，主要有球形、近球形、長球形或超長球形等；另外，不同種類的油茶花粉外壁紋飾、花粉粒的大小以及赤道面觀等也呈現不同的狀態(tài)。普通油茶的花粉形態(tài)為近球形或者橢球形，為3孔溝形，大小中等，符合山茶屬花粉的種屬特征[16-19]。

2.2 花粉活力及柱頭可授性

花粉活力及柱頭可授性是開花植物有性生殖的基礎，花粉活力對植物的坐果率有很大影響，花粉活力高、花粉量大，植物坐果率高。檢測花粉活力的方法多樣，主要有I-KI法、MTT法、過氧化氫酶法、TTC法、離體萌發(fā)法、統(tǒng)計坐果率法等。不同測定方法對花粉生活力的測定結果也有一定的影響。袁德義等[20]選取7種油茶種花粉為材料，得出花粉生活力的最佳方法為TTC法、FDA熒光染色法及離體萌發(fā)法，這3種方法也可用于檢測山茶屬花粉活力。

在雜交中，如果親本花期相差時間較長，則需要儲藏花粉以備授粉，要求花粉保持較高的生活力。低溫干燥有利于油茶花粉的貯藏，普通油茶花粉經過烘干脫水后，含水量在15%以下時，超低溫條件下可保存一年左右，且活力無顯著降低；短期貯藏可4℃低溫干燥保存[21-22]。

柱頭可授性也是開花植物有性生殖過程的研究基礎，在生殖過程中常常會由于親本生殖發(fā)育最佳時期難相遇而影響雜交。通過全面了解親本之間的物候規(guī)律，掌握好最佳授粉時間，從而提高授粉坐果率。長林53號油茶柱頭的可授期共有6 d，為開花前3 d至開花后3 d；其中開花前2 d和開花后2 d為最佳可授期[23]。普通油茶和小果油茶開花時，花粉就具活力，活力最高時為花后1 h；花后1～4 d是最佳傳粉期，此時花粉能保持較高活力。開花前2 h，柱頭就具可授性，開花后3～4 h可授性達最高，花后4 d開始下降，至6 d柱頭枯萎，與兩者開花進程相同。2種油茶柱頭從開花至枯萎一般需5～6 d，其中柱頭可授性最強的時間在開花后的2 d之內，隨后開始柱萎[24]。

3 有性生殖過程研究

3.1 小孢子和雄配子體的發(fā)生與發(fā)育

油茶花粉壁從外至里分別為表皮層、纖維層、中層和絨氈層4層，絨氈層分泌胼胝質酶使小孢子分離，合成識別蛋白并釋放到花粉外壁。絨氈層在小孢子形成時開始解體，花粉粒成熟時只剩殘跡[14]。

即使同一立地條件下的同一油茶植株，其不同花之間進入減數分裂的時間差可達45 d[25]。不同花之間，同一花的不同花藥之間，發(fā)育也不同步，母細胞處于減數分裂時，花藥為乳白略帶淡黃；花粉進入四分體時期時，花藥呈黃色。四分體解體后釋放單個的小孢子，油茶小孢子經過2次有絲分裂，形成花粉[26-28]。

3.2 大孢子和雌配子體的發(fā)生與發(fā)育

油茶雌蕊由3～5心皮組成，子房3～5室，每室著生倒生胚珠3～10枚，一般為5～6枚。油茶胚珠珠柄極短，由于胚珠在生長過程中形狀各有不同，因此在子房中的位置也不同[29]。

大孢子母細胞由孢原細胞直接發(fā)育而來，經減數分裂形成二分體，二分體先后經過3次連續(xù)分裂，最后形成成熟的八核胚囊，即雌配子體[30]。

3.3 油茶授粉受精過程研究

油茶花粉粒傳到柱頭上后，被柱頭液粘附，花粉粒吸收柱頭液而膨脹，幾個小時便能從萌發(fā)孔處萌發(fā)出花粉管，穿入柱頭通向子房[26]?；ǚ酃苓M入子房，從胚珠穿入胚囊，一個精細胞與卵細胞結合，形成合子，后發(fā)育成胚；另一個精細胞與次生核受精，形成胚乳，完成受精全過程，油茶受精最適宜溫度為20℃。油茶胚囊在發(fā)育過程中，有少數形成多卵，多個卵細胞受精后，單粒種子中不止一個胚，稱為多胚現象[31]。

3.4 果實與種子發(fā)育

未受精的子房在花后一周內脫落，受精的子房翌年發(fā)育為果皮，胚珠形成種子，每個子房室最終只有1～6個胚珠形成種子[30]。油茶受精卵的分化多在翌年3—5月進行，3月初以前子房開始膨大，形成幼果；自3月起至8月下旬，果實生長迅速，8月后體積不再增加，油脂開始積累。8—9月，子葉吸收所有的胚乳，種子內部再無游離胚乳存在，外種皮變?yōu)辄S褐色，10月份外種皮轉為黑褐色，子葉脆硬，幼胚具發(fā)芽能力，果實成熟。

8—9月是油茶果實中油脂的形成與積累期，9月下旬至采收前，油脂含量大量增加，因此過早采收會大大降低果實含油量。油茶油脂形成的過程，也受多種外界因素的影響，溫度和濕度尤為重要，可制訂合理技術措施提高種子產量和產油量。

3.5 植物生長調節(jié)劑對油茶生殖生長的調控

植物生長調節(jié)劑可以有效調節(jié)林木的生長發(fā)育，達到增產、增強抗逆性、提高品質的目的，在油茶中多用于花器官噴施。有學者認為，CTK促進油茶開花，高水平IAA、GAs、ABA促進花的凋落，ABA/CTK、ABA/GAs有利于花芽的形態(tài)建成，噴施復硝酚鈉可以提高普通油茶花芽中的ZR、IAA、GA3，從而提高坐果率[32-33]。隨后，通過對不同品種油茶花器官發(fā)育的調控研究發(fā)現，低濃度的赤霉素、多效唑有助于油茶成花，赤霉素和細胞分裂素的交互作用是促進油茶提前開花的關鍵因子；同時，花芽分化期噴施赤霉素能顯著提高油茶果實品質[34-37]。劉林秀等[38]發(fā)現，適宜濃度的6-BA、GA、ABA可促進油茶花粉管生長。胡瀟[39]發(fā)現，內源乙烯是導致油茶落果的重要激素，其中ACS1、ACO1、ACO2等7個基因可能是油茶落果過程中的關鍵基因[40]。

4 油茶的雜交育種研究

4.1 自交不親和性研究

自交不親和是植物在受精過程中發(fā)生真的識別和拒絕自交花粉的機制[41]。80年代以來，國內學者對油茶品種間雜交親和性進行了研究，結果表明：影響雜交親和性的因素有很多，如參與雜交的父本與母本親緣關系的遠近、花粉與柱頭的識別、花粉的質量、花粉母細胞在減數分裂過程中染色體的配對行為、花粉在柱頭及子房中的萌發(fā)行為等[42-43]。

高超等[41]以‘華碩’為試材，通過解剖學結果發(fā)現，自交花粉管生長速度明顯低于異交花粉管，且大部分未到達子房就生長停滯，明確油茶為自交不親和性植物。廖婷等[44]發(fā)現，油茶異交授粉座果率、果實品質等均優(yōu)于自交和自然條件授粉，屬后期自交不親和。

油茶自交結實率低，實際生產中，選擇親和性較高的油茶為主栽品種，加之品種配置種植，配栽品種通常為5～10個。楊小胡等[45]以‘華金’為試材，發(fā)現人工輔助授粉坐果率明顯高于自然授粉；在高產良種中，篩選出品種配置的良好組合為：湘林5作為父本，湘林67、湘林3號作為母本。在此基礎上，劉慧敏等[46]通過調查60個湘林系列無性系品種，建立了湘林系列油茶栽培的品種配置模式。長林系列油茶品種配置試驗表明，父本對子代的坐果率和種子含油率具顯著影響[47]。贛州油茶品種配置時，應優(yōu)先考慮花期一致、花粉活力強、親和性高的品種[48]。

4.2 雜交育種方法和親本選擇

在現階段油茶育種方式主要為雜交育種，包括種內、種間雜交育種[49-50]。油茶雜交育種能否取得成功的關鍵之一，是正確地選擇雜交親本。選擇的父母本都要具有較多的優(yōu)點，且沒有突出的缺點，其中一方對當地的環(huán)境條件應有良好的適應性，花期要一致等。一般情況下，父、母本的開花期至少要有1/2～1/3重疊。在油茶雜交育種中，通常選擇開花量較大的母本，在盛花期，花蕾全白含苞欲放時進行去雄，去雄后1～2 d內，柱頭上分泌出黏液時，是授粉最適宜時間。用毛筆蘸取花粉，涂在柱頭上，授粉完畢后立即套袋掛牌標記。授粉后7～10 d，觀察到花瓣凋謝，柱頭干枯時，即可去袋[14]。

陳雅等[50]用攸縣油茶與‘華碩’進行種間雜交，子代育性良好，回交結實率高。陳永忠等[51]通過雜交育種選育的子代，產量大幅升高。不同品種間雜交親和性不同導致油茶花粉管的生長速度不同[52]。江西省林業(yè)科學院進行油茶遠緣雜交育種試驗，發(fā)現雜交后代均表現出果大、皮薄、出籽率高、含油率高的特點[53-54]。

5 展望

2022年中央一號文件《中共中央國務院關于做好2022年全面推進鄉(xiāng)村振興重點工作的意見》提出“支持擴大油茶種植面積，改造提升低產林”，2022年海南省一號文件《中共海南省委海南省人民政府關于做好2022年全面推進鄉(xiāng)村振興重點工作的實施意見》（瓊發(fā)〔2022〕1號）提出“推廣種植油茶、沉香、花梨、特色花卉”和“擴大椰子、油茶、沉香、咖啡等種植規(guī)模”。發(fā)展油茶產業(yè)已上升為國家和海南省的戰(zhàn)略性部署，種植油茶已成為農民脫貧致富和鄉(xiāng)村振興的重要途徑。擴大油茶種植面積以及提高單位面積產量，將油茶培育成為食用油的重要來源，潛力巨大。

我國具有豐富的油茶實生資源和品種資源，為適應油茶育種工作的需要，在開花生物學、花粉儲藏和胚胎學等方面都進行了大量研究，并取得不少有價值的材料，但研究方法還比較傳統(tǒng)，油茶落花落果問題長期未得到解決，有性生殖尚未形成系統(tǒng)的理論體系。自然條件下，油茶各品種的自交不親和程度差異巨大，今后的研究方向中，油茶自交不親和的機制、各品種間不親和強度差異的原因及如何克服自交不親和性或將成為重要內容[26,55]。

目前，油茶基因組已經破譯，實現了油茶從傳統(tǒng)育種向基因組育種的跨越，也為開花調控、果實發(fā)育等相關機制解析，關鍵功能基因的挖掘奠定了良好基礎。油茶育種年限長，新品種選育緩慢，選育速度無法滿足產業(yè)發(fā)展需求，嚴重阻礙了油茶產業(yè)的發(fā)展。通過分子輔助育種，開展重要經濟性狀的分子標記輔助精準預測，有望縮短油茶育種周期，提高油茶育種效率[56]。