西格列汀對2型糖尿病伴慢性心力衰竭病人心功能及外周血單個核細(xì)胞Sirt3/NF-κB通路的影響

王林青，孫云靜，張亞靜，薛潔乾，周 松

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)是慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的獨(dú)立危險因素，其中左室舒張功能障礙是T2DM的典型表現(xiàn)，也是影響CHF病人不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素[1]。臨床研究顯示，β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑等常規(guī)藥物難以有效改善T2DM伴CHF病人的左室舒張功能，且降糖治療無法改善T2DM病人的心血管疾病發(fā)生風(fēng)險，強(qiáng)化血糖控制不能降低心力衰竭住院或死亡風(fēng)險，因此改進(jìn)治療方案是臨床關(guān)注的重點(diǎn)[2-3]。相關(guān)研究顯示，二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑(西格列汀)通過增加活性腸促胰島激素水平，以葡萄糖依賴方式增加胰島素釋放，降低胰高糖素水平，從而發(fā)揮良好的降糖效果[4]。西格列汀通過抑制機(jī)體炎性因子水平，從而發(fā)揮血管、心臟保護(hù)作用，降低心力衰竭和心血管死亡的風(fēng)險[5]，關(guān)于西格列汀在T2DM伴CHF中的應(yīng)用價值尚未明確。外周血單個核細(xì)胞沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶3(silencing regulator 2 related enzyme 3，Sirt3)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)，如NF-κB是炎癥反應(yīng)核心因子，在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，引起心肌缺血損傷，且Sirt3/NF-κB通路在CHF發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[6]。本研究觀察西格列汀治療T2DM伴CHF的療效及其對外周血單個核細(xì)胞Sirt3/NF-κB通路的影響，從而為臨床治療方案的制定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月—2020年2月我院收治的146例T2DM伴CHF病人，采用隨機(jī)數(shù)字法分為觀察組和對照組，每組73例。兩組臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。病人入組前均簽署知情同意書，且本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合2017年《中國糖尿病防治栺南中華內(nèi)分泌指南》[7]中的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)；符合2018年《中國心力衰竭診斷和治療指南》[8]中CHF的診斷標(biāo)準(zhǔn)；心功能分級Ⅰ～Ⅲ級。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并精神、血液、免疫系統(tǒng)疾病病人；1型糖尿病病人；CHF急性加重；合并肝、腎等臟器功能嚴(yán)重異常；患有肺源性心臟病、先天性心臟病、心臟瓣膜器質(zhì)性病變、心房顫動、心律失常等嚴(yán)重心臟疾病；既往服用DPP-4抑制劑。

1.3 治療方法 所有病人參照相關(guān)指南接受常規(guī)降糖[7-8]、抗心力衰竭治療，如β-受體阻滯劑降低心率，利尿劑降低心臟負(fù)荷，抗血小板或抗凝藥物治療，他汀類調(diào)脂，糾正水鹽電解質(zhì)紊亂，口服降糖藥物二甲雙胍。治療期間密切關(guān)注血糖、血壓、心功能，并規(guī)范飲食、作息。觀察組口服西格列汀(杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片100 mg，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20140095)，每日100 mg。兩組均治療3個月。

1.4 療效評定標(biāo)準(zhǔn) 治療3個月后評估療效[8]，顯效：胸悶、氣短、心悸、呼吸困難、運(yùn)動受限等癥狀基本消失或完全消失，紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級改善超過2級，或恢復(fù)至正常狀態(tài)；有效：胸悶、氣短、心悸、呼吸困難等癥狀好轉(zhuǎn)，NYHA分級改善1級；無效：臨床癥狀及心功能分級均改善，甚至惡化。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心功能指標(biāo) 治療前及治療3個月后采用GE Vivid E9超聲儀測定左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、舒張期室間隔厚度(IVST)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，測量3個心動周期，取平均值。

1.5.2 外周血單個核細(xì)胞內(nèi)Sirt3/NF-κB通路相關(guān)mRNA 分別于治療前及治療3個月后采集病人外周靜脈血3 mL，共3管，第1管室溫離心10 min，重力加速度250×g，棄去上層血漿，下層細(xì)胞使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)平衡溶液稀釋，于15 mL離心管中加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，加入細(xì)胞稀釋液，室溫離心10 min，重力加速度800×g，棄去上層液，吸取中間層液體，取5 mL PBS平衡溶液，再次離心15 min，重力加速度700×g，棄去上清液，剩余的顆粒狀細(xì)胞為外周血單個核細(xì)胞。采用TRIzol試劑盒提取PBMCs內(nèi)的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾)反轉(zhuǎn)錄RNA，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。擴(kuò)增條件為90 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續(xù)循環(huán)30次。以U6作為內(nèi)參，根據(jù)Sirt3、NF-κB的mRNA與U6的Ct值計算相對表達(dá)量，以2-△△Ct表示，其中△△Ct=(Ct目的基因-CtU6)-(Ct對照目的基因-Ct對照U6)。

表2 引物序列

1.5.3 血糖水平監(jiān)測 第2管外周靜脈血采用全自動生化分析儀檢測病人空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(1 hPG)及餐后2 h血糖(2 hPG)。

1.5.4 炎癥反應(yīng)指標(biāo)測定 第3管外周靜脈血以3 000 r/ min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液保存于-80 ℃待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，采用免疫比濁法測定血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。

1.5.5 主要不良心血管事件(MACE) 記錄治療期間MACE發(fā)生情況，包括再發(fā)心肌梗死、心力衰竭、心絞痛等。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床療效比較 觀察組治療總有效率(93.15%)高于對照組(82.19%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組臨床療效比較

2.2 兩組心功能指標(biāo)比較 治療后，兩組LVEDD、IVST下降，LVEF增加，且治療后觀察組心功能指標(biāo)優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

2.3 兩組外周血單個核細(xì)胞Sirt3/NF-κB通路相關(guān)mRNA水平比較 治療后，兩組外周血單個核細(xì)胞Sirt3 mRNA水平增加，NF-κB mRNA水平下降，其中觀察組Sirt3 mRNA水平高于對照組，而NF-κB mRNA水平低于對照組(P<0.05)。詳見表5。

2.4 兩組血糖水平比較 治療后，兩組FPG、1 hPG、2 hPG水平均呈下降趨勢，其中觀察組血糖各指標(biāo)水平低于對照組(P<0.05)。詳見表6。

單位：mmol/L

2.5 兩組血清炎性因子水平比較 治療后，兩組血清IL-6、TNF-α及CRP水平均下降，其中觀察組血清炎性因子水平均低于對照組(P<0.05)。詳見表7。

2.6 兩組MACE發(fā)生情況比較 治療期間，觀察組和對照組MACE發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(5.48%和10.96%，P>0.05)。詳見表8。

表8 兩組MACE發(fā)生情況比較

3 討 論

T2DM合并心力衰竭是臨床的常見疾病，有研究顯示，40%～50%的T2DM病人合并心力衰竭，且合并心力衰竭可進(jìn)一步增加T2DM病人心血管死亡風(fēng)險，因此，有效控制血糖對改善病人心功能具有重要的臨床意義[1]。有研究顯示，DPP-4抑制劑(西格列汀、沙格列汀、維格列汀等)具有良好的降糖效果，可發(fā)揮心血管保護(hù)作用(抗炎、降壓、抗動脈粥樣硬化、降脂、改善心功能等)，從而降低心血管事件風(fēng)險及心力衰竭住院風(fēng)險[9]。目前，病人接受西格列汀治療后獲益的潛在機(jī)制尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，觀察組總有效率高于對照組，表明在常規(guī)藥物治療基礎(chǔ)上使用西格列汀可顯著改善T2DM伴CHF病人氣短、心悸、胸悶、呼吸困難等臨床病癥及心功能分級，增加活動耐量，從而發(fā)揮良好的治療作用。西格列汀通過抑制DPP-4防止胰高血糖素樣肽-1及葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽的快速降解，從而增加內(nèi)源性胰高血糖素樣肽-1和抑胃肽水平，刺激胰島素分泌，并降低胰高糖素水平，故治療后血糖指標(biāo)明顯降低。謝云亮等[10]動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，西格列汀通過激活環(huán)狀腺苷酸/蛋白激酶A/Rac相關(guān)C3肉毒素底物1(cAMP/PKA/Rac1)信號通路，抑制脾臟CD4+T細(xì)胞的遷徙能力，可減輕炎癥反應(yīng)及非肥胖型糖尿病小鼠胰島炎癥浸潤情況，增加胰島存活和體內(nèi)胰島素水平，發(fā)揮良好的降糖效果。西格列汀通過增加胰高血糖素樣肽-1水平，改善血管內(nèi)皮功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌細(xì)胞壞死，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，治療后，觀察組心功能指標(biāo)(IVST、LVEDD、LVEF)改善程度優(yōu)于對照組，進(jìn)一步證實(shí)西格列汀的心臟保護(hù)作用。西格列汀通過抑制Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號通路，降低炎性因子(單核細(xì)胞趨化蛋白-1、NF-κB)水平，增加基質(zhì)細(xì)胞源性因子-1α水平，減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)，從而保護(hù)血管，改善心功能[10-11]。本研究治療后，觀察組炎性因子水平降低，心功能指標(biāo)水平改善。 多項研究顯示，Sirt3/NF-κB通路具有調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，心肌缺血損傷等作用，Sirt3可促使線粒體中乙?；鞍兹ヒ阴；?，進(jìn)而參與細(xì)胞能量代謝、活性氧清除的過程，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，而NF-κB為炎癥反應(yīng)核心因子，參與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等生理活動，加重心肌細(xì)胞損傷和疾病進(jìn)展[12-13]。王韋等[14]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可調(diào)控外周血單個核細(xì)胞內(nèi)Sirt3/NF-κB通路，減輕CHF病人炎癥反應(yīng)，改善心功能分級，降低不良心臟事件風(fēng)險，提高臨床療效。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血單個核細(xì)胞Sirt3 mRNA水平增加，NF-κB mRNA水平下降(P<0.05)，表明西格列汀通過調(diào)控外周血單個核細(xì)胞Sirt3/NF-κB通路，降低炎癥反應(yīng)，改善病人心功能。Sirt3可激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，進(jìn)而降低血管內(nèi)皮生長因子、低氧誘導(dǎo)因子-2表達(dá)，抑制血管新生，通過抑制心肌組織NF-κB，減輕炎癥反應(yīng)和心肌組織纖維化，發(fā)揮心臟保護(hù)功能[15]，結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為，西格列汀可能通過上調(diào)Sirt3表達(dá)抑制NF-κB表達(dá)，進(jìn)而降低炎性因子(IL-6、TNF-α及CRP)表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，避免心臟結(jié)構(gòu)功能改變，發(fā)揮治療效果。有研究認(rèn)為，Sirt3作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性去乙?；钢唬{(diào)控線粒體內(nèi)蛋白去乙?；?，抑制氧自由基形成，發(fā)揮抗氧化作用，延緩細(xì)胞凋亡、衰老[16]。楊榮培等[17]研究顯示，使用槲皮素可調(diào)控Sirt1/NF-κB信號通路，從而減輕大鼠左心室肥厚程度及心肌纖維化，使用特異性抑制劑調(diào)控Sirt1/NF-κB，再次上調(diào)NF-κB表達(dá)，阻斷槲皮素的心臟保護(hù)作用。結(jié)合本研究結(jié)果推斷西格列汀可能參與調(diào)控Sirt3/NF-κB通路進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

綜上所述，西格列汀治療T2DM伴CHF療效顯著，可有效調(diào)控血糖水平，降低炎癥反應(yīng)，改善心功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)控外周血單個核細(xì)胞內(nèi)Sirt3/NF-κB通路有關(guān)。