中藥復(fù)方調(diào)控GRP78、CHOP改善代謝綜合征大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究

黃理安，黃孝靜，羅保平

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是以中心性肥胖、脂代謝異常、高尿酸、高血壓為主要特征，胰島素抵抗為共同的病理生理基礎(chǔ)，多種物質(zhì)代謝異常的一組復(fù)雜證候群，是1型糖尿病和心腦血管疾病的代謝性危險(xiǎn)因素，但病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確[1]。MS主要臨床表現(xiàn)為肥胖、高血壓、胰島素抵抗等靶器官損傷[2]，這些心血管危險(xiǎn)因素聚集表現(xiàn)為對(duì)腎臟損害有協(xié)同作用[3]，腎臟損傷的臨床表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率高，尿清蛋白排泄率增加，腎小管功能改變[4-5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，精血互生，以養(yǎng)肝木，疏肝理氣；腎精不足，陰虛陽亢，以致肝失疏泄，氣化失司，中焦氣機(jī)壅滯，運(yùn)化失常，加重體內(nèi)痰濕，導(dǎo)致肥胖及血脂紊亂更甚[6]。因此，MS不僅導(dǎo)致心血管事件發(fā)生危險(xiǎn)增加，同時(shí)損害腎臟，腎臟損害又反之加重MS的心血管并發(fā)癥，因此，腎臟損害的早期發(fā)現(xiàn)和治療應(yīng)受到高度重視[7]。

臨床治療MS的原則以逆轉(zhuǎn)糖代謝異常、脂代謝紊亂、高血壓、胰島素抵抗、降低心血管風(fēng)險(xiǎn)等為主，常用的藥物以西藥居多，但治療時(shí)常出現(xiàn)副作用：西布曲明可能導(dǎo)致神經(jīng)性厭食癥，奧利司他可能導(dǎo)致脂溶性維生素缺失，噻嗪類利尿劑可能誘發(fā)胰島素抵抗從而升高血糖及三酰甘油水平，導(dǎo)致電解質(zhì)紊亂，β受體阻滯劑可能抑制胰島素分泌而誘發(fā)糖尿病。由于該病的影響因素較多，使療效難以滿意。中藥復(fù)方對(duì)MS的防治已廣泛應(yīng)用于臨床[8]。小檗堿作為常用藥物的主要有效成分，可發(fā)揮提高胰島敏感性、降低血糖、改善脂質(zhì)紊亂的作用[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中一種重要的亞細(xì)胞器，主要功能為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、折疊、運(yùn)輸及修飾，當(dāng)某些錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一系列功能的紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，是MS腎損害的重要發(fā)病機(jī)制之一[10]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)參與了這一病理過程[11]，血尿酸(blood uric acid，UA)與MS腎損害密切相關(guān)[12]。本研究觀察中藥復(fù)方對(duì)MS大鼠空腹胰島素(FINS)水平、血脂含量、血UA及腎小管組織GRP78、CHOP表達(dá)的影響，以期為臨床診治MS大鼠腎損傷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 中藥復(fù)方：黃連15 g，黃芪20 g，地黃10 g，五味子10 g，蒼術(shù)15 g，茯苓15 g，麥冬10 g，共95 g，飲片均由江中飲片廠生產(chǎn)，制成粗粉，與適量水煮沸30 min，粗濾，反復(fù)3次，濾液合并濃縮至30 mL，稀釋至0.2 g/mL水煎液備用。小檗堿溶液：精密稱取鹽酸小檗堿，以甲醇溶解并稀釋制成0.04 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡Wistar大鼠80只，飼養(yǎng)于動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物室，體質(zhì)量160～180 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2017-0067，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)實(shí)施。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷照顧。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 果糖(Amres-co，美國)；鹽酸小檗堿(北京中新制藥廠，國藥準(zhǔn)字H11020962)；鼠抗GRP78多抗(novus，貨號(hào)：H00003309-A01)；兔抗CHOP mAb(Sino Biolgical，美國)；山羊抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多抗(Sino Biolgical，美國)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x購自上海欣軟科技有限公司；AU2700全自動(dòng)生化分析儀購自日本Olympus公司；SMZ645型光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型建立 將80只2月齡Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組、小檗堿組，每組20只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，對(duì)照組予以普通飲食及飲用凈化自來水，其余大鼠用10%果糖水代替正常飲水，持續(xù)8周。8周后應(yīng)用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，對(duì)血脂、血壓及空腹胰島素水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的造模大鼠，認(rèn)為造模成功。用藥劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[12]中按“人與動(dòng)物體表面積折算”，中藥組以中藥復(fù)方1.0 g/(kg·d)灌胃，每日1次；小檗堿組以小檗堿100 mg/(kg·d)灌胃，每日1次；對(duì)照組及模型組予以等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。干預(yù)8周后測(cè)量各組大鼠生化指標(biāo)、胰島功能、血壓水平。

1.2.2 大鼠尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定 各組大鼠第2周開始于清醒、安靜狀態(tài)下，采用無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x，測(cè)量清醒狀態(tài)下大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。

1.2.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，采用酶比色法測(cè)定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、UA和空腹血糖(FBG)含量；放射免疫法測(cè)定血清FINS水平。

1.2.4 樣本收集 斷頸處死各組大鼠，留取血液樣本，取一側(cè)腎臟，部分置于10%多聚甲醛中固定，-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 腎臟組織病理學(xué)檢查 腎臟組織經(jīng)10%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋后，制成3 μm的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精、糖原(PAS)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎臟微細(xì)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)GRP78、CHOP的mRNA表達(dá)水平 取冷凍的腎臟，用預(yù)冷的裂解液進(jìn)行組織勻漿，離心收集上清液，依次加入三氯甲烷及異丙醇進(jìn)行萃取，萃取后離心得到RNA沉淀，之后用75%乙醇洗滌2次后晾干，加入DEPC水溶解得到RNA溶液，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法將其合成為cDNA。依據(jù)設(shè)計(jì)的GRP78、CHOP引物，采用RT-PCR試劑盒及基因特異性引物進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)曲線計(jì)算mRNA表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，以各條帶光密度與GAPDH條帶的比值作為相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)及收縮壓比較 與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠FBG、FINS、TG、TC、收縮壓、BUN及Scr水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和小檗堿組生化指標(biāo)及收縮壓均有不同程度下降，且中藥組下降程度更顯著(P<0.05)。詳見表2。

2.2 各組大鼠腎臟微細(xì)結(jié)構(gòu)變化 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小球局灶節(jié)段性系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少；中藥組、小檗堿組大鼠腎組織病理改變均較模型組輕微，其中中藥組大鼠僅見輕度系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多，腎小管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)基本消失；小檗堿組大鼠腎組織病理僅見少量系膜細(xì)胞增生。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)水平比較 模型組GRP78、CHOP mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)；與模型組相比，中藥組和小檗堿組GRP78、CHOP mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，且中藥組表達(dá)少于小檗堿組(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)條帶圖

表3 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

有研究顯示，MS作為一種代謝性疾病，其發(fā)病率及致死率均逐步升高，威脅我國人民的健康[13]。目前治療MS無標(biāo)準(zhǔn)指南，臨床主要是針對(duì)各項(xiàng)危險(xiǎn)因素進(jìn)行有效干預(yù)。中醫(yī)學(xué)以預(yù)防腎損害為主，充分體現(xiàn)了未病先防、既病防變的治未病思想和理念。中醫(yī)藥治療或改善MS諸癥，取得了一定的療效，相關(guān)中藥復(fù)方和活性成分的研究和新藥開發(fā)取得了一定程度的進(jìn)展[14]。有研究顯示，從黃連中提取出的小檗堿通過降糖、降脂、糾正代謝紊亂等改善胰島素抵抗，達(dá)到防治MS的目的，黃連中的多種復(fù)合成分針對(duì)MS的多靶點(diǎn)治療優(yōu)于小檗堿已被證實(shí)[15]。有研究通過超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)探討黃芪湯中的潛在活性成分，鑒定出了17種提示腎病綜合征的生物標(biāo)志物，同時(shí)，篩選出治療腎病綜合征的活性成分，如芬芳因G加氫、粉防己堿、芳膽堿、甘草酸等[16]，中藥復(fù)方在治療MS中發(fā)揮了重要作用。

本研究結(jié)果顯示，中藥復(fù)方、小檗堿均能降低MS大鼠FBG、FINS、TG、TC、收縮壓、BUN、UA及Scr水平，其中，中藥組各指標(biāo)水平降低更顯著；顯微鏡觀察可見中藥組大鼠腎組織病理改變較MS大鼠顯著改善，說明中藥復(fù)方對(duì)減輕MS大鼠的腎損害有確切的療效。GRP78在緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用，GRP78表達(dá)上調(diào)具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性，可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性因子[17]。早期研究發(fā)現(xiàn)，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射引起正常小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并導(dǎo)致腎臟功能損害，而CHOP mRNA敲除小鼠存在嚴(yán)重的腎臟損害[18]。因此，推測(cè)腎功能損害與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的CHOP有關(guān)，CHOP是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥組、小檗堿組大鼠腎組織GRP78及CHOP mRNA表達(dá)均有不同程度減少，其中，中藥組兩種基因表達(dá)減弱顯著，接近對(duì)照組大鼠。為此提出假說，中藥復(fù)方可能通過調(diào)節(jié)GRP78及CHOP基因的表達(dá)而作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，以此減輕MS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激腎臟細(xì)胞損傷而發(fā)揮作用。分析原因可能與中藥復(fù)方的藥理作用有關(guān)。詹玫琦等[20]實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃連可改善大鼠糖脂代謝紊亂，降低血糖和血脂及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)。Zhou等[21]研究證實(shí)，黃連堿通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，減輕內(nèi)皮功能障礙，改善血管功能，從而減輕細(xì)胞損傷。張曉鳳等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可降低高糖誘導(dǎo)的GRP78、CHOP高表達(dá)，抑制H9c2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞過度凋亡，從而改善MS誘導(dǎo)的大鼠腎臟細(xì)胞凋亡。藥理研究發(fā)現(xiàn)，地黃具有抗氧化、抗凋亡等作用，其有效成分可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少細(xì)胞損傷[24-25]。Cheng等[26-27]研究顯示，采用不同濃度的五味子乙素干預(yù)后，細(xì)胞相對(duì)存活率升高，且GRP78、CHOP水平降低，提示五味子乙素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕細(xì)胞損傷。王清華等[28]研究顯示，蒼術(shù)可減輕細(xì)胞炎性水腫，降低細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞介質(zhì)含量和細(xì)胞內(nèi)GRP78高表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。多項(xiàng)研究顯示，茯苓的有效成分如茯苓多糖、茯苓酸等均可抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)[29-30]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，麥冬皂苷D可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[31]。

中藥復(fù)方治療MS所致腎損害，調(diào)節(jié)GRP78及CHOP基因的表達(dá)，有可能成為干預(yù)和治療MS的有效措施，為MS腎損害的治療提供新思路和新方法。