基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鹿角方治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制

蘭真真，瞿惠燕，戎靖楓，楊 濤，楊曉利，周 華

慢性心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的復(fù)雜臨床綜合征，為各種心臟疾病的終末階段，因具有較高的發(fā)生率與死亡率，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，心力衰竭病人平均每日至少需使用5種處方藥物，加重了病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，疊加了藥物不良反應(yīng)[2-3]。中藥復(fù)方因多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)，治療慢性心力衰竭等機(jī)制復(fù)雜的慢性疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。由于中藥多成分等復(fù)雜性使其主要療效物質(zhì)及機(jī)制不明確，導(dǎo)致中藥不能被廣泛接受和應(yīng)用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門以系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和高通量組織學(xué)為基礎(chǔ)，集藥理學(xué)和信息網(wǎng)絡(luò)為一體的綜合學(xué)科。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與多元藥理學(xué)結(jié)合，系統(tǒng)分析藥物治療疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制[4]。由此可見(jiàn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)特征與中醫(yī)藥的整體觀念和辨證論治理論一致，使其成為研究中醫(yī)藥機(jī)制的最佳工具。

鹿角方(專利號(hào)：ZL 2006 1 0147305.0)是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科治療心力衰竭的常用方，因其良好的臨床療效已在臨床應(yīng)用數(shù)十年。相關(guān)研究證實(shí)，鹿角方可增強(qiáng)心臟收縮功能，顯著改善心力衰竭病人臨床癥狀[5-6]，但作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鹿角方治療慢性心力衰竭的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為鹿角方進(jìn)一步應(yīng)用與研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 鹿角方成分靶點(diǎn)的篩選 中藥成分復(fù)雜，一般認(rèn)為被吸收入血的成分才可發(fā)揮作用。通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)鑒定出鹿角方的6種入血成分為補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、馬錢苷、莫諾苷、紅景天苷、寶霍苷Ⅰ[7]。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取上述6種成分的2D化學(xué)結(jié)構(gòu)式，通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)式在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 慢性心力衰竭靶點(diǎn)的篩選 以“chronic cardiac failure”“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中收集匯總慢性心力衰竭的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 蛋白-蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線作圖平臺(tái)對(duì)鹿角方作用靶點(diǎn)與慢性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互作得分(highest confidence)設(shè)定為0.9，其余設(shè)置均為默認(rèn)值，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。其中節(jié)點(diǎn)(node)表示靶點(diǎn)，邊(edge)表示靶點(diǎn)間的關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 為闡述潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)及在信號(hào)通路中的作用，將鹿角方與慢性心力衰竭交集靶點(diǎn)提交至DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，設(shè)定靶點(diǎn)為“official gene symbol”，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，閾值P<0.05，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO功能富集分析結(jié)果以條形柱狀圖形式呈現(xiàn)；KEGG分析結(jié)果以氣泡圖和表格形式呈現(xiàn)。

1.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analysis工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等，根據(jù)度值篩選鹿角方的主要活性成分。

2 結(jié) 果

2.1 鹿角方相關(guān)作用靶點(diǎn) 經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，其中，補(bǔ)骨脂素有效靶點(diǎn)20個(gè)、異補(bǔ)骨脂素有效靶點(diǎn)20個(gè)、馬錢苷有效靶點(diǎn)39個(gè)、莫諾苷有效靶點(diǎn)21個(gè)、紅景天苷有效靶點(diǎn)23個(gè)、寶霍苷Ⅰ有效靶點(diǎn)23個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到有效靶點(diǎn)71個(gè)。

2.2 慢性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn) 從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得慢性心力衰竭靶點(diǎn)9 300個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，疾病靶點(diǎn)過(guò)多時(shí)，設(shè)定Score大于中位數(shù)為疾病的潛在靶點(diǎn)。9 300個(gè)靶點(diǎn)中Score最大為108.43，最小為0.13，計(jì)算中位數(shù)為3.67，故設(shè)定Score≥3.67的靶點(diǎn)為慢性心力衰竭的主要潛在靶點(diǎn)。結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值共得到慢性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)4 655個(gè)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)Venn平臺(tái)繪制鹿角方與慢性心力衰竭作用靶點(diǎn)韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)47個(gè)，詳見(jiàn)圖1。將藥物與疾病交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0平臺(tái)，得到藥物與疾病交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖2。去除游離節(jié)點(diǎn)后，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)39個(gè)、邊113條，平均節(jié)點(diǎn)度值4.81，平均局部聚類系數(shù)0.389，其中蛋白激酶C(PRKCA)、腎上腺素能受體2A(ADRA2A)、腎上腺素能受體2C(ADRA2C)、糖原合酶激酶3β(GSK3B)、細(xì)胞色素P450 1B1(CYP1B1)、蛋白激酶Cε(PRKCE)、B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子核因子1(NFKB1)、腺苷酸激酶(ADK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)度值和聚類系數(shù)均大于均值，為鹿角方治療慢性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)，詳見(jiàn)表1。

圖1 鹿角方-慢性心力衰竭韋恩圖

圖2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)

2.4 GO功能富集分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。結(jié)果顯示，47個(gè)靶點(diǎn)富集于102個(gè)生物學(xué)過(guò)程(GO-BP)。其中，與慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的有氧化還原反應(yīng)(oxidation-reduction process)、對(duì)缺氧的反應(yīng)(response to hypoxia)和MAP激酶活性的正調(diào)控(positive regulation of MAP kinase activity)等。細(xì)胞成分(GO-CC)主要涉及細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、質(zhì)膜(plasma membrane)、外泌體(extracellular exosome)、線粒體(mitochondrion)等。分子功能(GO-MF)主要富集于ATP結(jié)合(ATP binding)、蛋白質(zhì)均二聚活性(protein homodimerization activity)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等，詳見(jiàn)圖3。

圖3 GO富集分析條形柱狀圖

2.5 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析顯示，47個(gè)靶點(diǎn)富集于50條通路。其中，與慢性心力衰竭密切相關(guān)的有胰島素抵抗通路(insulin resistance pathway)、甲狀腺激素信號(hào)通路(thyroid hormone signaling pathway)、血管平滑肌收縮通路(vascular smooth muscle contraction pathway)、VEGF信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)等。排名居前10位的通路見(jiàn)表2。通過(guò)通路氣泡圖對(duì)通路中的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行可視化分析，氣泡大小代表靶點(diǎn)數(shù)量，氣泡顏色由綠色至紅色代表P值由大到小，詳見(jiàn)圖4。

表2 KEGG富集分析居前10位的通路

圖4 KEGG通路氣泡圖

2.6 成分-靶點(diǎn)-通路分析 將成分、靶點(diǎn)及作用通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖5。其中圓形代表入血成分，正方形代表交集靶點(diǎn)，三角形代表通路。形狀的大小根據(jù)度值大小進(jìn)行排列，度值越大，形狀越大。利用Network Analyzer工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，馬錢苷連接度為21，介度為0.264 570，緊密度為0.465 839，為鹿角方治療慢性心力衰竭的主要有效成分，其次為寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、莫諾苷，詳見(jiàn)表3。

圖5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表3 鹿角方主要成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)

3 討 論

慢性心力衰竭歸屬于中醫(yī)學(xué)“喘癥”“痰飲”“水腫”等范疇，病位在心，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。心為陽(yáng)中陽(yáng)臟，血脈運(yùn)行全賴心中陽(yáng)氣的推動(dòng)。心陽(yáng)的充足需腎陽(yáng)不斷化生資助，心陽(yáng)虛可損及腎陽(yáng)，腎陽(yáng)虛亦可損及心陽(yáng)。因此，心腎陽(yáng)虛貫穿慢性心力衰竭發(fā)展的始終。鹿角方是基于心力衰竭發(fā)病機(jī)制及心腎相關(guān)理論創(chuàng)制，由鹿角、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、山茱萸、女貞子、沉香組方而成。方中鹿角、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、山茱萸皆為溫補(bǔ)腎陽(yáng)之品，以助心陽(yáng)生發(fā)；女貞子滋補(bǔ)肝腎，寓以陰中求陽(yáng)之意，加強(qiáng)本方的溫陽(yáng)功效；沉香行氣止痛，為行氣理氣之佳品，使本方補(bǔ)而不滯，滋而不膩。諸藥合用，共奏補(bǔ)心腎之功效，從根本治療慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

相關(guān)研究表明，各種原因產(chǎn)生的能量減少與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[8]。胰島素抵抗通路與甲狀腺激素信號(hào)通路可調(diào)節(jié)心肌能量代謝，參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。甲狀腺素是一種必需激素，與生長(zhǎng)、凋亡和能量代謝有關(guān)。有研究顯示，30歲以上的女性甲狀腺功能減退可增加10年心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，甲狀腺素可激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMPK)通路，促進(jìn)線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ激活，逆轉(zhuǎn)能量衰竭和線粒體腫脹，改善心臟功能障礙[10]。胰島素作為一種代謝激素，與心肌能量、結(jié)構(gòu)、功能和機(jī)體存活密切有關(guān)。胰島素抵抗病人因代謝途徑改變、能量代謝失衡、心肌收縮力受損等多種機(jī)制促進(jìn)心力衰竭發(fā)生[11]。有研究表明，胰島素抵抗通路失調(diào)通過(guò)下游蛋白激酶B(AKT)和叉頭盒蛋白(FoxO)等信號(hào)通路，影響線粒體功能、心臟能量代謝和腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促進(jìn)心力衰竭發(fā)生，血管平滑肌收縮通路與VEGF通路是調(diào)節(jié)血管舒張的重要通路[12]。有研究表明，血管張力和擴(kuò)張是外周血容量的重要決定因素，可對(duì)心室前負(fù)荷和后負(fù)荷產(chǎn)生影響[13]。血管阻力增加、順應(yīng)性降低是慢性心力衰竭病人的重要特征。因此，調(diào)節(jié)血管舒張?jiān)诼孕牧λソ咧委熤邪l(fā)揮著重要作用。除調(diào)節(jié)血管舒縮功能外，VEGF通路通過(guò)促進(jìn)血管新生、抑制心肌細(xì)胞凋亡等，延緩心室重構(gòu)，抑制心力衰竭進(jìn)展[14-15]。相關(guān)研究顯示，VEGF缺失的小鼠因循環(huán)系統(tǒng)紊亂進(jìn)展為心力衰竭[16]。本研究結(jié)果顯示，鹿角方通過(guò)多靶點(diǎn)干預(yù)多條通路，協(xié)同干預(yù)慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，延緩疾病進(jìn)程。

目前，臨床藥物開(kāi)發(fā)的主導(dǎo)模式是針對(duì)某一靶點(diǎn)設(shè)計(jì)最具選擇性的配體[17]。然而，單一靶點(diǎn)藥物常低于預(yù)期臨床療效，一方面由于人體是一個(gè)微妙的動(dòng)態(tài)平衡體，另一方面基于任何一種疾病都不是單一靶點(diǎn)作用的結(jié)果。網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)分析表明，疾病網(wǎng)絡(luò)一般不受單個(gè)節(jié)點(diǎn)的影響。針對(duì)復(fù)雜疾病，需要生物網(wǎng)絡(luò)中具有協(xié)同效應(yīng)的組合節(jié)點(diǎn)，才能產(chǎn)生期望的治療效果[18]。慢性心力衰竭是一個(gè)多種病理機(jī)制的復(fù)雜疾病，目前臨床中常用藥物均是針對(duì)其中某一環(huán)節(jié)或靶點(diǎn)發(fā)揮作用，導(dǎo)致慢性心力衰竭只能在某一個(gè)指標(biāo)得以改善，從而難以真正抑制心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，鹿角方通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路、協(xié)同作用慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的多個(gè)機(jī)制，進(jìn)而發(fā)揮協(xié)同治療作用。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析及富集分析明確了鹿角方治療慢性心力衰竭的可能機(jī)制，即通過(guò)胰島素抵抗、甲狀腺激素信號(hào)、血管平滑肌收縮、VEGF信號(hào)等通路，優(yōu)化能量代謝，調(diào)節(jié)血管舒張，提高心肌細(xì)胞的抗缺氧能力，保護(hù)受損心肌，進(jìn)而抑制心力衰竭進(jìn)程。本研究為鹿角方作用機(jī)制的研究提供方向。