基于網(wǎng)絡藥理學探討水蛭治療急性心肌梗死的作用機制

歐陽嘉慧，孟閆燕，張 帆，林宮羽，杜天依，李立志，高鑄燁

心肌梗死是一種由心肌氧供需失衡導致心肌細胞死亡的綜合征，繼發(fā)于急性動脈粥樣硬化斑塊破裂或無動脈粥樣硬化斑塊形成時心肌氧供應和/或需求失衡[1]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)臨床表現(xiàn)為持續(xù)性胸痛及大汗，伴乏力、惡心、呼吸短促、肩頸部放射性疼痛等不適，少部分病人無急性癥狀[2]。隨著循證醫(yī)學的發(fā)展及生活方式的改善，心肌梗死患病率、死亡率得到有效控制，但AMI仍具有高患病率、高死亡率、高致殘率的特點[2]。中醫(yī)學根據(jù)AMI的癥狀特點，將其歸屬于“厥心痛”“胸痹心痛”“真心痛”等范疇。中醫(yī)學認為真心痛多與年老體衰、過食肥甘、煙毒損害、寒邪侵襲有關(guān)，導致人體血瘀痰濁，閉塞心脈，心脈不通，發(fā)為心痛[3]。中藥水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為水蛭科動物螞蟥、水蛭或柳葉螞蟥的干燥全體，其味咸苦，性平，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥的功效[4]。現(xiàn)代藥理研究顯示，水蛭具有抗炎、抗血栓、抗凝、調(diào)節(jié)脂代謝、保護內(nèi)皮細胞等生物活性，對治療AMI有積極的作用，但作用機制尚未明確[5]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法探討水蛭治療AMI的潛在機制和靶點，以期為實驗研究及臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 水蛭活性成分的篩選及靶點預測 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)，以“shui zhi”為檢索詞，設(shè)定“藥物-靶點”相似性模型閾值Score cutoff≥20、Pvalue≤0.05為閾值，檢索篩選水蛭的活性成分及其潛在靶點。

1.2 AMI相關(guān)靶點的獲取 以“acute myocardial infarction”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出相關(guān)性分數(shù)(relevance score)≥10的靶點，與另外3個數(shù)據(jù)庫檢索出的靶點合并、去重、整理后得到AMI的相關(guān)靶點。

1.3 “藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用Venny 2.1.0在線工具，將AMI的疾病靶基因與水蛭活性成分對應的靶基因進行映射后構(gòu)建韋恩圖，獲得兩者的共同靶點，即為水蛭活性成分治療AMI的潛在作用靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。

1.4 水蛭活性成分與AMI共同靶點的蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建 將水蛭與AMI的共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)，物種限定為人類(Homo sapiens)，設(shè)定最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)0.400，其余參數(shù)保持不變，獲取PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)。將PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)的結(jié)果保存為TSV格式后，導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制水蛭活性成分與AMI的共同靶點PPI網(wǎng)絡圖。

1.5 基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes，KEGG)通路富集分析 將水蛭治療AMI的潛在作用靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html)，設(shè)定Pvalue<0.01、min overlap≥3、min enrichment≥1.5為篩選閾值，對導入的作用靶點分別進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，探討水蛭治療AMI的潛在作用機制。

2 結(jié) 果

2.1 水蛭的活性成分及靶點 通過檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，設(shè)定Score cutoff≥20 及Pvalue≤0.05為篩選閾值，獲得水蛭的有效成分15個，其中2個有效成分未檢索到相關(guān)的靶點，故進行靶點預測時將其舍去；最終篩選出13個水蛭的活性成分；13個活性成分對應449個靶基因，剔除重復值后，共獲得水蛭活性成分潛在作用靶基因342個，活性成分信息見表1。

表1 水蛭活性成分

2.2 AMI靶點的獲取 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(設(shè)定相關(guān)性分數(shù)≥10為篩選閾值)、OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫，檢索出AMI的疾病相關(guān)靶點分別為606個、205個、3個、33個，剔除重復靶點后，最終獲得AMI疾病靶基因783個。

2.3 “藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡的構(gòu)建 將水蛭13個活性成分對應的342個靶基因與783個AMI疾病靶基因在Venny 2.1.0 在線工具中進行映射后構(gòu)建韋恩圖，獲得64個藥物-疾病共同靶點，推測其為水蛭治療AMI的潛在作用靶點，詳見圖1。將64個作用靶點及對應的水蛭13個活性成分導入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，詳見圖2。其中度值(Degree值)較高的活性成分為藏紅花酸、熊果酸、D-甘露庚酮糖、L-半乳庚酮糖，這些成分可能是水蛭治療AMI的主要活性成分。

圖1 水蛭活性成分-AMI靶點韋恩圖

圖2 水蛭治療AMI的“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖(綠色箭頭為水蛭活性成分；粉紅色八邊形為靶點)

2.4 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 將64個水蛭治療AMI的作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，獲取PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，并將結(jié)果保存為TSV格式后，導入Cytoscape 3.7.2軟件中，繪制水蛭活性成分與AMI的共同靶點PPI網(wǎng)絡圖，詳見圖3。PPI網(wǎng)絡圖中共有64個節(jié)點、342條相互作用連線，節(jié)點平均度值為10.7；根據(jù)度值大小篩選出PPI網(wǎng)絡中度值居前10位的作用靶點，分別為胰島素(INS)、清蛋白(ALB)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素1β(IL1β)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、脂聯(lián)素(ADIPOQ)、CC趨化因子配體2(CCL2)、胰島素樣生長因子1(IGF1)，居前6位的度值均≥25，提示這些靶點可能是水蛭治療AMI的潛在核心靶點，詳見圖4。

圖3 水蛭治療AMI作用靶點的PPI網(wǎng)絡圖

圖4 水蛭治療AMI的作用靶點(度值居前20位)

2.5 GO功能富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫對水蛭治療AMI的64個作用靶點進行GO功能富集分析，共得到86個條目，其中59個與生物過程(biological process，BP)相關(guān)，9個與細胞組分(cellular component，CC)相關(guān)，18個與分子功能(molecular function，MF)相關(guān)。GO功能富集分析結(jié)果顯示：水蛭治療AMI主要涉及血液循環(huán)、炎癥反應、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)、系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、分泌物的調(diào)節(jié)、對氧水平的反應等生物過程；涉及膜筏、質(zhì)膜外側(cè)、肌膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、突觸前膜的組成部分、整合素復合物等細胞組分；涉及核受體活性、受體調(diào)節(jié)活性、有機酸結(jié)合、血紅素結(jié)合、整合素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。詳見圖5。

圖5 水蛭治療AMI的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫對水蛭治療AMI的64個作用靶點進行KEGG通路富集分析，共得到20條富集通路，詳見圖6、表2。相關(guān)基因主要富集在非酒精性脂肪肝、癌癥、癌癥中的蛋白聚糖等疾病通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(cGMP-PKG)等通路。提示上述通路可能是水蛭發(fā)揮治療AMI的核心通路。

圖6 水蛭治療AMI的KEGG信號通路富集分析

表2 水蛭治療AMI的KEGG通路

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，居全球人類死亡原因首位[6]，AMI是冠心病的嚴重表現(xiàn)之一。《中國心血管健康與疾病報告2020概要》指出，從2005年開始，我國AMI死亡率呈快速升高趨勢，2002年—2018年，城市地區(qū)AMI死亡率從16.46/10萬升至63.33/10萬，農(nóng)村地區(qū)AMI死亡率從12.00/10萬升至78.47/10萬[7]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學治療AMI包括藥物、經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)、冠狀動脈旁路移植，但存在心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion，IR)、手術(shù)治療風險較高等不足。中醫(yī)學認為真心痛的主要病機為血瘀痰濁、閉塞心脈，治療原則多以活血化痰、祛瘀止痛為主[8]。水蛭具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥之功效[9]，張錫純稱其“破瘀血而不傷新血，純系水之精華生成，于氣分絲毫無損，而瘀血默消于無形，真良藥也”。脂質(zhì)堆積、血小板過度激活、胰島素抵抗、體重增加是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂的危險因素，炎癥、氧化應激是心肌梗死和心肌缺血再灌注后繼發(fā)性損傷的重要機制[10]。因水蛭含有高效抗凝血物質(zhì)，具有抗氧化應激、抗炎、調(diào)節(jié)脂代謝及抗血小板聚集等功效[11-12]，其防治AMI受到越來越多的關(guān)注。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探討水蛭治療AMI的活性成分、潛在作用靶點和作用通路，為今后的研究提供方向和思路。

本研究共篩選出水蛭活性成分13個、對應靶點342個。其中，水蛭與AMI的共同靶點64個，結(jié)合“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖結(jié)果顯示，藏紅花酸、熊果酸、L-半乳庚酮糖、D-甘露庚酮糖等是與AMI相關(guān)疾病靶點作用最多的活性成分，提示這些成分可能與水蛭發(fā)揮治療AMI的作用機制密切相關(guān)。藏紅花酸具有改善缺氧組織的氧合、抗氧化應激、抗炎癥等多種藥理學作用，通過抑制心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)缺氧復氧后Nox2活性，減少CMECs細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，從而發(fā)揮緩解CMECs缺血再灌注損傷的作用，通過抑制線粒體Ca2+濃度升高，保護心肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷及功能[13-14]。熊果酸通過降低溶酶體損傷和(或)增加溶酶體穩(wěn)定性，從而減輕心肌缺血后溶酶體酶釋放導致的心肌細胞損傷和死亡，通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)表達，從而抑制心肌纖維化[15]。根據(jù)PPI網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，水蛭治療AMI的靶基因中，度值較高的為INS、ALB、TNF、IL1β等，推測其為水蛭抗AMI的核心靶點。INS是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，由胰臟的胰島β細胞分泌。相關(guān)研究顯示，INS抵抗及高INS分泌可能影響機體炎癥反應、氧化應激程度，增加肥胖、糖尿病、高脂血癥發(fā)生風險，影響一氧化氮(NO)合成及生物利用度，損害血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性，刺激血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移和增殖，促進動脈粥樣硬化斑塊形成，最終發(fā)展為冠心病、心肌梗死[16-18]。ALB是一種負性急性時相反應蛋白，低清蛋白水平是首發(fā)AMI病人全因死亡率、心血管死亡率和心臟死亡率的獨立預測因子，可能與其抗炎癥反應的作用受限有關(guān)[19-20]。TNF-α和IL1β是重要的促炎癥細胞因子；梗死心肌局部TNF-α升高可誘導活躍的局部炎癥反應、基質(zhì)和膠原降解及MMPs活性增加，導致急性心肌破裂和慢性左心室功能障礙[21]。IL1β是白細胞介素-1基因家族的主要成員，通過誘導趨化因子造成血管內(nèi)皮損傷，增加成纖維細胞膠原酶表達，抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導，導致心肌重塑不良，且與AMI后心臟破裂密切相關(guān)[22-23]。水蛭通過調(diào)節(jié)INS、ALB、TNF、IL1β等靶點發(fā)揮治療AMI的作用。

GO功能富集分析顯示，水蛭治療AMI的功能主要體現(xiàn)在核受體活性、受體調(diào)節(jié)活性、有機酸結(jié)合、血紅素結(jié)合、整合素結(jié)合等分子功能；血液循環(huán)、炎癥反應、脂質(zhì)定位、系統(tǒng)過程、分泌物、對氧水平的反應等生物過程；涉及膜筏、質(zhì)膜外側(cè)、肌膜等細胞組分。

KEGG通路富集分析顯示，水蛭通過對20條AMI相關(guān)通路的作用達到治療AMI的目的，其中包括疾病通路和信號通路。主要疾病通路包括非酒精性脂肪肝、癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖等。非酒精性脂肪肝參與并增強機體內(nèi)氧化應激反應及炎癥反應，誘導機體內(nèi)凝血功能障礙、脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗等途徑，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[24]。蛋白聚糖具有調(diào)節(jié)腫瘤生長及調(diào)節(jié)新血管生成的功能，在癌癥和血管生成中發(fā)揮多種功能，調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號通路促進血管生成，推測水蛭通過癌癥中的蛋白聚糖通路發(fā)揮治療AMI的作用[25]。主要信號通路包括鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、cGMP-PKG等。鈣信號通路可介導心臟細胞收縮-舒張、調(diào)節(jié)細胞凋亡，在心功能的調(diào)節(jié)、心肌細胞結(jié)構(gòu)及功能的調(diào)節(jié)、維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用[26]。調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路可維持缺血期及再灌注期心肌線粒體功能，從而發(fā)揮心肌的保護與修復作用[27]。血清素能突觸又名5-羥色胺能突觸，是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血管舒張的作用，選擇性5-羥色胺激動劑可能有助于預防心肌梗死[28]。血管內(nèi)皮細胞是心肌缺血再灌注損傷中重要的靶細胞，cGMP-PKG信號通路具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞運動、遷移和增殖的作用，介導內(nèi)皮依賴的血管舒張、血管新生和血管的通透性，PKG被認為是cGMP-PKG信號通路的重要下游靶點，上調(diào)PKG信號通路可拮抗PCI術(shù)后血管內(nèi)皮損傷[29]。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，對水蛭治療AMI的作用機制進行初步探討，結(jié)果表明，水蛭可能通過藏紅花酸、熊果酸、L-半乳庚酮糖、D-甘露庚酮糖等活性成分，調(diào)節(jié)INS、ALB、TNF、IL1β等關(guān)鍵基因的表達，進而作用于鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、cGMP-PKG信號通路等發(fā)揮治療AMI的作用，為水蛭的進一步研究及臨床應用提供新思路和方向。