新型四倍體水稻創(chuàng)制及其雜種優(yōu)勢(shì)利用研究進(jìn)展

劉向東 吳錦文 SHAHID Muhammad Qasim

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2. 廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642）

多倍體植物在自然界中廣泛存在。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，自然界中50%-70%的被子植物，包括許多重要的農(nóng)作物曾發(fā)生一次或多次多倍化［1-2］。多倍體植物具有生長健壯、抗逆性強(qiáng)、果實(shí)大和營養(yǎng)成分高等優(yōu)點(diǎn)，創(chuàng)制和利用多倍體是植物育種的重要途徑之一［3-6］。由我國創(chuàng)制并在青藏高原大面積種植的八倍體小黑麥就是多倍體育種的一個(gè)成功案例。

水稻是世界上最主要的糧食作物之一。目前生產(chǎn)上大面積推廣的水稻是二倍體，尚沒有多倍體推廣應(yīng)用［3］。已報(bào)道的多倍體水稻主要是指由二倍體水稻通過染色體加倍而形成的同源四倍體水稻［7-8］。與其他多倍體植物一樣，同源四倍體水稻表現(xiàn)為籽粒增大、蛋白質(zhì)含量提高［9］、耐鹽性和抗性增強(qiáng)［10-13］等特點(diǎn)。此外，同源四倍體水稻雜種F1具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，其后代可產(chǎn)生與二倍體不同的基因重組，可為創(chuàng)造稀有材料及優(yōu)良新品種提供一種新途徑［14-16］。因此，開展多倍體水稻研究對(duì)于開辟水稻育種新途徑及其相關(guān)基礎(chǔ)研究具有重要意義［2-5，14-21］。

1 同源四倍體水稻研究概況

同源四倍體水稻研究可追溯到20世紀(jì)30年代。日本于1933年最早報(bào)道了自然形成的同源四倍體水稻，次年又通過人工加倍二倍體水稻獲得了同源四倍體水稻。1950-1960年期間，日本科學(xué)家開展了同源四倍體水稻及其雜種細(xì)胞的遺傳學(xué)研究并取得了一些有價(jià)值的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雜種F1育性提高，染色體配對(duì)異常率比親本低［7］。但1960年以后至今，國外（包括日本在內(nèi)）有關(guān)同源四倍體水稻的研究報(bào)道卻不多。

我國自1951年開展四倍體水稻的研究，1956年報(bào)道誘導(dǎo)出同源四倍體水稻，并研究發(fā)現(xiàn)同源四倍體水稻育性普遍偏低，但秈型和粳型同源四倍體水稻雜交F1育性明顯提高，可能具有應(yīng)用前景［8］。20世紀(jì)80-90年代期間，我國科學(xué)家通過雜交育種結(jié)合花藥培養(yǎng)技術(shù)，選育出同源四倍體水稻優(yōu)良無性系并在生產(chǎn)上試種，其中有些品系產(chǎn)量超過二倍體水稻［9］。20世紀(jì)90年代以后，國內(nèi)陸續(xù)有多家單位開展多倍體水稻研究，并取得重要進(jìn)展，主要表現(xiàn)為以下3方面：

（1）建立了高效的秋水仙堿誘導(dǎo)加倍技術(shù)，創(chuàng)制出一大批不同類型攜帶優(yōu)異基因的同源四倍體水稻材料，包括攜帶廣親和基因、質(zhì)核互作和光溫敏核雄性不育基因、無芒基因的同源四倍體水稻，以及攜帶“秈粳雜種F1花粉不育”基因的同源四倍體水稻近等基因系等［5，22-23］。培育出同源四倍體水稻光溫敏核雄性不育系［24］，組配出同源四倍體水稻強(qiáng)優(yōu)組合［25-26］。涂升斌等［25］報(bào)道建立了水稻同源四倍體的雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)體系，選育出同源四倍體水稻雄性不育系近千份、保持系和恢復(fù)系各20多份，組配出T462A×T4509強(qiáng)優(yōu)組合，成功地通過三系配套實(shí)現(xiàn)了四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用。

（2）闡明同源四倍體水稻低育性的細(xì)胞學(xué)和分子遺傳學(xué)原因。研究發(fā)現(xiàn)，同源四倍體水稻花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期間染色體行為普遍存在異常現(xiàn)象，花粉和胚囊發(fā)育過程、受精、胚胎和胚乳發(fā)育過程中均存在不同程度的異?，F(xiàn)象，這些異常都可能是引起同源四倍體水稻育性偏低的細(xì)胞學(xué)原因［27-33］。在分子遺傳層面，與二倍體水稻原種比較，同源四倍體水稻花粉和胚囊發(fā)育期間育性相關(guān)基因存在異常表達(dá)、甲基化程度改變和非編碼RNA（包括lncRNA和miRNA等）的異常表達(dá)等［29-30，34-37］。比如，同源四倍體水稻減數(shù)分裂相關(guān)的基因OsDMC1、OsMS2、PAIR2和OsMTOPVIB等，以及小孢子發(fā)育期間糖代謝相關(guān)基因OsSUT5和OsMST8等均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)［23，30］。Wu 等［22］發(fā)現(xiàn)同源四倍體水稻雜種花粉不育基因多座位（SaiSaiSajSaj、SbiSbiSbjSbj和SciSciScjScj）互作在多倍性的遺傳背景下具有類似“上位性”的加強(qiáng)效應(yīng)，可引起包括RAD51和泛素E3連接酶OsPUB73等基因在內(nèi)的減數(shù)分裂期相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)，使花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂期就出現(xiàn)明顯異常，進(jìn)一步引起小孢子發(fā)育異常，最終使雜種花粉高度不育，較好地解釋了同源四倍體水稻雜種育性偏低的分子遺傳原因。值得一提的是，花粉育性“中性基因”可以克服多座位互作引起的不育性，為同源四倍體水稻亞種間的雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了可能［23，28，38］。此外，Wu 等［15］發(fā)現(xiàn)同源四倍體水稻雜種后代發(fā)生了廣泛的、個(gè)性化的部分同源交換（HE），引起部分同源染色體片段的拷貝數(shù)變化，進(jìn)而影響已知功能基因及其互作，使多倍體群體水平表型產(chǎn)生多樣性，增強(qiáng)其進(jìn)化潛力。

（3）創(chuàng)制（培育）了高育性四倍體水稻新材料。我國科學(xué)家為了解決同源四倍體水稻育性偏低的瓶頸問題，經(jīng)過多年努力創(chuàng)制出高育性的四倍體水稻新材料［21，39-40］。其中，研究較多的分為兩類：一類是“減數(shù)分裂穩(wěn)定多倍體水稻”（polyploid meiosis stability，PMeS，以下簡稱“PMeS 水稻”）［5，39，41-42］。PMeS水稻的育性超過65%，其與同源四倍體水稻雜交，F(xiàn)1結(jié)實(shí)率超過70%；經(jīng)進(jìn)一步改良后育性可達(dá)到80%以上［5，39］。擬南芥同源基因MND1在PMeS水稻減數(shù)分裂過程中起了重要作用［43］。第二類便是新型四倍體水稻（neo-tetraploid rice）［17，40，44-45］。

2 新型四倍體水稻創(chuàng)制過程及主要特點(diǎn)

新型四倍體水稻是通過同源四倍體水稻Jackson-4x（美國稻Jackson加倍獲得同源四倍體水稻，由中國科學(xué)院華南植物園黎垣慶提供）與96025（中國農(nóng)科院作物所選育，趙開軍提供）進(jìn)行雜交，并經(jīng)過多年多代選育而成［17］。其中華多1號(hào)和華多2號(hào)兩個(gè)品系分別于2009年和2010年育成，2016年獲得國家植物新品種權(quán)［17］。由于該多倍體水稻既不同于由二倍體水稻直接加倍獲得的同源四倍體水稻，也不同于異源四倍體水稻。所以，我們參照新型四倍體擬南芥（neo-tetraploid Arabidopsis）的表述［46］，于 2017年首次以“neo-tetraploid rice”（中文“新型四倍體水稻”）在國際學(xué)術(shù)刊物上報(bào)道了新型四倍體水稻華多3號(hào)［40］。此后，又報(bào)道了 華 多 1 號(hào)［47］、 華 多 2 號(hào)［17，45］、 以 及 華 多 4-8號(hào)［44，48］。其中，華多8號(hào)是一份長穗型并具有廣親和基因的新型四倍體水稻［44］。新型四倍體水稻主要有以下5方面特點(diǎn)：

（1）育性高。新型四倍體水稻育性高達(dá)80%［17，23，40，44-45］，而同源四倍體水稻的育性一般在0-70%之間波動(dòng)，參數(shù)在50%以下。

（2）新型四倍體水稻攜帶多種優(yōu)異基因，包括廣親和基因、花粉育性“中性基因”和高育性基因等，可以作為多倍體水稻育種的骨干親本［23，44］。

（3）新型四倍體水稻基因組中存在豐富的DNA變異。其中，最有特點(diǎn)的是兩類，一類是非親本型的變異基因（non-parental genes），也就是在雜交的高代材料中，產(chǎn)生雙親都沒有的變異位點(diǎn)（基因）。例如，在13份新型四倍體水稻中共檢測(cè)到222個(gè)非親本型的變異基因［45］；第二類是全新等位變異基因，即存在與二倍體水稻和同源四倍體水稻完全不同的新等位變異，如熱激蛋白新等位變異基因“HSP101-1”等［49］。

（4）新型四倍體水稻類型獨(dú)特。Yu等［49］通過PCA（principal components analysis）、系統(tǒng)發(fā)育和ADMIXTURE的群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)新型四倍體水稻具有與同源四倍體水稻和二倍體水稻不同的變異基因，分類屬于獨(dú)立的亞群，偏粳但與典型粳稻分屬不同的亞群。

（5）新型四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)且可保持多代。新型四倍體水稻與秈型同源四倍體水稻雜交F1育性高達(dá)90%，產(chǎn)量超親優(yōu)勢(shì)十分明顯，部分雜交組合的超親優(yōu)勢(shì)大于140%，產(chǎn)量可超過二倍體水稻推廣品種黃華占。新型四倍體水稻雜種后代（F2-F5）仍可以保持高育性和較高的產(chǎn)量優(yōu)勢(shì)［44］，顯示出該四倍體水稻在雜種優(yōu)勢(shì)利用，特別是多代優(yōu)勢(shì)利用上具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 新型四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)及其分子遺傳研究

新型四倍體水稻的雜種F1不僅具有生物學(xué)優(yōu)勢(shì)，而且還表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)量優(yōu)勢(shì)。自2016年以來，本團(tuán)隊(duì)利用新型四倍體水稻與不同類型四倍體水稻雜交并組配了超過70個(gè)組合，發(fā)現(xiàn)雜種F1優(yōu)勢(shì)明顯，其中包括單株實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量的中親優(yōu)勢(shì)均達(dá)到顯著水平，超親優(yōu)勢(shì)也十分明顯。統(tǒng)計(jì)其中53個(gè)組合的雜種優(yōu)勢(shì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量中親優(yōu)勢(shì)平均值分別為84.41%、32.94%和106.58%；超親優(yōu)勢(shì)平均值分別為59.27%、13.83%和75.82%［40，44］。新型四倍體水稻與秈型同源四倍體水稻雜交F1的產(chǎn)量優(yōu)勢(shì)顯著高于與粳型同源四倍體水稻雜交F1的優(yōu)勢(shì)，這可能與新型四倍體水稻偏粳型有關(guān)。其中，4001-4x×華多8號(hào)和Bengal-4x×華多8號(hào)兩個(gè)組合的理論產(chǎn)量均超過二倍體水稻推廣品種，應(yīng)用潛力較大［44-45］。利用同源四倍體水稻增城絲苗-4x與新型四倍體水稻華多8號(hào)組配的雜種F1，其粒型和外觀均偏向絲苗米，表現(xiàn)出籽粒細(xì)長、米粒外觀透明，有望培育出優(yōu)質(zhì)四倍體雜交稻。

為揭示新型四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)的分子遺傳機(jī)理，本團(tuán)隊(duì)先后利用4個(gè)雜種F1及其雙親進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)新型四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生主要涉及 6 類基因的差異表達(dá)［23，40，44］：

（1）與育性相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，包括花粉發(fā)育相關(guān)基因，如DPW和CYP703A3基因等。這些基因的上調(diào)表達(dá)可能是雜種F1高育性的原因之一［23，40，44］。

（2）能量物質(zhì)合成相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，包括淀粉合成酶和糖代謝基因等。如MUT5和MTS8等基因在雜種F1高表達(dá)，OsBEIIb和OsSSIIIa在雜種F1開花后 3 d 的籽粒中表達(dá)上調(diào)［23，44］。

（3）編碼NBS-LRR抗病蛋白或LRR受體樣蛋白激酶基因。比如在（T485×H8）F1和（H1×H8）F1兩個(gè)組合中，共檢測(cè)到714個(gè)差異表達(dá)的已知基因，其中涉及抗性或耐受相關(guān)基因?yàn)?6個(gè)［44］。

（4）轉(zhuǎn)錄因子（TF）等。以上兩個(gè)組合共檢測(cè)到76個(gè)特異表達(dá)的 TF［44］。

（5）與產(chǎn)量相關(guān)的QTL。以上兩個(gè)組合共檢測(cè)到109個(gè)差異表達(dá)基因位于7個(gè)產(chǎn)量性狀相關(guān)QTL區(qū)間［44］。

（6）與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的已知基因等。以上兩個(gè)組合檢測(cè)到一些與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的差異基因，包括NAL1、Gn1a、qGW8、OsGA20ox1、Ghd8、GW6a、LP1 和 EUI1、i-sd-1（t）、sd1、OsGA20ox2 和 qSD1-2（dee-geo-woo gen dwarf）、DEP1、DN1、qPE9-1 和qNGR9（密穗）等，說明與二倍體雜交稻雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的基因很可能在四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)中也發(fā)揮作用［44］。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)新型四倍體水稻雜種的差異表達(dá)基因具有特異性，即存在與二倍體雜交稻不同的差異表達(dá)基因。新型四倍體水稻的（黃華占-4x×華多8號(hào)）F1和（華多1號(hào)×華多8號(hào)）F1兩個(gè)組合中，發(fā)現(xiàn)其中差異表達(dá)的21個(gè)NBS-LRR基因和71個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TF）與超級(jí)雜交水稻LYP9（兩優(yōu)培九）的不同。與LYP9的進(jìn)行比較，其中57個(gè)QTL是不同的［44］，包括4個(gè)與結(jié)實(shí)有關(guān)（AQGH011、AQGH028、AQCB017和 AQED063）、15個(gè) 與 生 物產(chǎn)量有關(guān)、14個(gè)與穗數(shù)有關(guān)、24個(gè)與穗粒數(shù)有關(guān)的QTL。有趣的是，比較4個(gè)不同新型四倍體水稻的雜種F1，發(fā)現(xiàn)其中48個(gè)差異基因位于產(chǎn)量相關(guān)QTL區(qū)間，包括2個(gè)與千粒重相關(guān)（AQAI071和CQB16）、3個(gè)與結(jié)實(shí)相關(guān)（AQGH011、AQGH028和 CQB14）、13個(gè)與穗數(shù)相關(guān)的 QTL（AQCY027、AQGM014、CQK1、CQK2、CQK18、CQK19、CQAS135、CQJ1、CQJ2、CQJ4、CQJ9、AQFF055和AQFF061）；此外，新型四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生還可能涉及“非加性表達(dá)的基因”（nonadditiveexpressed genes）的表達(dá)［44］。

上述研究結(jié)果說明，新型四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)的分子遺傳機(jī)理較為復(fù)雜，與二倍體水稻具有相似之處，如雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的顯性基因聚集等；但也存在不同之處，如檢測(cè)到特異的抗性、轉(zhuǎn)錄因子和QTL等。

4 挑戰(zhàn)與展望

中國水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用研究在世界上處于領(lǐng)先地位，為世界特別是我國糧食安全做出了巨大貢獻(xiàn)。但應(yīng)該指出，二倍體水稻育種也面臨巨大的挑戰(zhàn)，這主要是因?yàn)槿蛎媾R兩大問題：一是人口不斷增加帶來的糧食安全問題。據(jù)預(yù)測(cè)，到2050年全球糧食需求比現(xiàn)在將增加50%［4］。所以，包括水稻在內(nèi)的主要糧食作物的單產(chǎn)亟待提高；二是全球氣候變暖、極端溫度、干旱和洪澇頻發(fā)、土壤退化、病蟲害爆發(fā)等因素嚴(yán)重威脅作物生長和收獲。為此，需要培育抗性更強(qiáng)的作物?，F(xiàn)有二倍體水稻基因組較小，基因組緩沖能力有限，能否適應(yīng)未來可能出現(xiàn)的劇烈環(huán)境變化還難以預(yù)測(cè)。為了應(yīng)對(duì)以上問題，科學(xué)家提出了兩條解決途徑：一是栽培稻的多倍化，培育四倍體水稻，利用四倍體水稻的高抗性和強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)；二是利用分子生物學(xué)技術(shù)加速異源四倍體野生稻的馴化，創(chuàng)制水稻新物種［4］。

新型四倍體水稻作為目前高育性的多倍體水稻之一，其雜種具有明顯的優(yōu)勢(shì)，而且可以保持多代，有望在多倍體水稻育種上取得重大突破。為了在生產(chǎn)上利用新型四倍體水稻的雜種優(yōu)勢(shì)，需要加快解決以下3個(gè)瓶頸：

（1）創(chuàng)制高效不育系。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除新型四倍體水稻的TMS5基因，高效選育四倍體水稻溫敏不育系。

（2）培育強(qiáng)恢復(fù)系。由于已報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一系列與四倍體水稻雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的基因，因此可利用水稻的海量重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組篩選，選出具有雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)基因優(yōu)異等位型的水稻品種（系），直接加倍獲得強(qiáng)恢復(fù)系與新型四倍體水稻不育系雜交，有望組配強(qiáng)優(yōu)組合。

（3）解決四倍體水稻種子的成本問題。二倍體水稻只能利用雜種F1的優(yōu)勢(shì)而無法利用F2及其后代的優(yōu)勢(shì)，所以需要年年制種，制種成本較高。而四倍體水稻每個(gè)基因組包含4條染色體，每個(gè)位點(diǎn)有4個(gè)等位基因。從理論上講，其雜合狀態(tài)可以持續(xù)多代，而且不同座位的雜合狀態(tài)可以保持更多世代。這為四倍體水稻的多代雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了理論基礎(chǔ)。有研究已初步證實(shí)四倍體水稻雜種自交后代的優(yōu)勢(shì)至少可以保持5代，即一次制種可以利用5代，使制種成本顯著降低。

目前，本團(tuán)隊(duì)已初步解決以上3個(gè)難題，有望在不遠(yuǎn)的將來取得突破，實(shí)現(xiàn)新型四倍體水稻的成功利用，為促進(jìn)水稻多倍體育種邁上新臺(tái)階作出貢獻(xiàn)。

致謝：謹(jǐn)以此文紀(jì)念盧永根院士在稻種資源保護(hù)與創(chuàng)新研究上的杰出貢獻(xiàn)。同時(shí)感謝本室其他成員及國內(nèi)同行專家多年來的大力支持。由于我國有關(guān)同源四倍體水稻研究文獻(xiàn)很多，所以，本文只列上部分文獻(xiàn)，特此說明。