基于高通量測序技術探究糖尿病足與健康人組織DNA中的5-羥甲基胞嘧啶變化

馬睿瑤，趙景會，儲金林，鐵 璐，李念東，李琳琳

0 引 言

糖尿病是最常見的疾病之一，糖尿病足(Diabetic foot ulcer，DFU)是糖尿病一種嚴重的并發(fā)癥，增加患者的經濟負擔，嚴重影響患者的生活，同時也是非創(chuàng)傷性下肢截肢的重要原因之一[1-2]。DNA中的5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)主要是由5mC通過10-11位易位(TET)酶氧化形成。最近的研究表明表觀遺傳學在糖尿病創(chuàng)面中的作用[3]，DNA甲基化對糖尿病足的恢復具有一定作用[4]，同時在健康人和糖尿病或糖尿病血管病變患者中檢測到不同水平的5hmC。因此，對糖尿病的另一種并發(fā)癥——糖尿病足的研究引起極大興趣。同時有研究表明，糖尿病患者的外周血中5hmC水平高于健康人[3]，糖尿病患者血漿中5hmC水平可用于判斷糖尿病患者是否存在并發(fā)癥[5]，但目前尚未有對糖尿病足潰爛組織中5hmC表達的報道。本研究使用5hmC-Seal技術[6]探究DFU和健康志愿者傷口組織DNA中的全基因組5hmC譜，篩選可能成為DFU的潛在治療分子靶點。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2021年1月至 12月北京大學第三附屬醫(yī)院傷口治療中心收治的6例糖尿病足患者組織為DFU組，男女各3例，選擇同期年齡匹配的3例健康志愿者潰爛組織為對照組，男1例，女2例。本研究通過北京大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批準號：M2020539)，患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 樣本制備與DNA提取取20 mg新鮮凍存組織于EP管中, 采用Quick-DNATMMini Prep Plus Kit (ZYMO) 對組織中總DNA進行提取，-20 ℃冰箱穩(wěn)定保存。按TRIzol?Reagent試劑盒說明操作測定組織中的總DNA。使用DNA進行5hmC文庫建立[6]。并在IlluminaNextSeq500平臺上進行高通量測序。

1.2.2測序數(shù)據的處理及分析通過Fragment Analyzer對每個文庫樣本的DNA條帶大小及定位進行分析，使用Illumina公司的Nextseq 500/550 High Output Kit v2(75 cycles)在NextSeq 500 測序平臺上進行雙端 38-bp高通量測序，每個樣本的測序通量為1.5Gb，條帶大小為38 bp，最終得到給定文庫中DNA片段的堿基序列。得到數(shù)據后，首先使用Trimmomatic軟件去除樣本中原始FASTQ中低質量的數(shù)據，以此提高后續(xù)分析效率。在使用Bowtie2軟件，使用將原始文件比對到人類hg19基因組上，使用SAMtools進行篩選，以保留唯一匹配值bedtools首先將對端讀取進行擴展并轉換為BedGraph格式，并將其進行歸一化處理，在使用UCSC基因組瀏覽器中的bedGraphToBigWig轉換為bigwig格式，可在Integrated Genomics Viewer中進行可視化處理，其次可以合并峰值，只保留出現(xiàn)在3個樣本以上且小于1000 bp的峰值區(qū)域。潛在的5hmC富集區(qū)域使用MACS識別(參數(shù)：MACS14-p1e-3-f BAM-g hs)。X和Y染色體被排除在外，生成文件作為后續(xù)分析文件[7]。

1.2.3篩選DhMGs用DEseq2軟件包進行差異分析，以P<0.05和|log2FoldChange|≥0.5的條件篩選出DhMGs。

1.2.4DhMGs調控網絡的構建與分析利用數(shù)據分析軟件STRING(https://string-db.org/)對248個DhMGs進行相互作用分析(置信度≥0.9，互作最大值=0)，并建立蛋白互作網絡 (PPI)。通過Cytoscape3.9.0(https://cytoscape.org/)軟件構建基因調控網絡，采用力導向算法讓節(jié)點的分布更加合理，得到更佳的視覺效果。再使用CytoHubba插件，選用MCC方法，從構建的PPI網絡中選取關鍵樞紐基因(Hub基因)。

1.2.5基因功能分析通過在線DAVID網站 (https://david.ncifcrf.gov/)對Hub基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集，分析這些基因的生物學過程、細胞組成和分子功能以及相關通路。

1.2.6熒光實時定量PCR (qRT-PCR)根據RNA快速提取試劑盒(EZB)說明書提取傷口組織總RNA，Nanophotometer P330測定RNA濃度。取1μg RNA，參照Vazyme公司逆轉錄試劑進行逆轉錄，將反轉得到的cDNA 與反應液加至 96 孔板，根據EZB 2×SYBR Green qPCR Master Mix在Bio-Rad Q-PCR 儀中進行實時熒光定量PCR擴增。反應條件為：95 ℃預變性5分鐘，95 ℃變性10秒，60 ℃退火/延伸30秒，共40個循環(huán)，以β-actin為內參，依據目的基因相對表達量RQ=2-△△Ct法計算基因mRNA的相對表達量，引物序列如表1所示。

表 1 qRT-PCR引物列表

1.2.7免疫組化石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯-乙醇-蒸餾水中洗滌。抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH 9.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，中火5 min加熱，停火5min保溫再轉中低火10min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。血清封閉：在組化圈內滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。敷一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。敷二抗：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育50min。DAB顯色：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。復染細胞核：蘇木精復染3 min左右，自來水洗，蘇木精分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木精返藍液返藍，流水沖洗。脫水封片：將切片依次放入酒精-二甲苯中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。分別加入一抗MAPK11(1∶200)和CDC42(1∶200)，二抗為HRP山羊抗兔(1∶200)。

2 結 果

2.1 5hmC-Seal測序結果測序數(shù)據分析顯示，DFU組的整體羥甲基化水平高于對照組。主成分分析圖結果顯示，利用變化的5hmC可以將DFU組和對照組區(qū)分開。見圖1。

a:5hmC在不同基因組特征中的分布圖； b:主成分分析圖

2.2DhMGs的篩選以P<0.05和|log2FoldChange|>0.5的條件下篩選出DhMGs，共有166個上調基因和262個下調基因，其中包括NDUFB6、GALR1、GDAP1等已知的與糖尿病并發(fā)癥相關的基因。DhMGs主要分布在內含子、基因間和啟動子區(qū)域。見圖2。

2.3DhMGs調控網絡的構建與Hub基因篩選涉及35個節(jié)點，見圖3。節(jié)點的顏色與Degree值密切相關，隨著節(jié)點增大，由藍變紅所代表的Degree值也隨之升高。邊的粗細程度則代表Combine score，隨著邊由細變粗，Combine score值也隨之變大。邊的顏色與coexpression值相關，隨著顏色由黃變?yōu)樽仙琧oexpression值也隨之變大，見圖3。通過CytoHubba分析可得到10個Hub DhMGs，分別是MAPK14、MAPK11、CDC42、MAP3K1、NCOA1、RAP1B、AGO4、RUNX1、HIF1A、PHC3，見表2。

a：DhMRs分布火山圖以紅色(DhMRs在糖足中表達上調)或綠色(DhMRs在糖足中表達下調)表示，黑點表示沒有差異表達；b: DhMRs基因組特征分布圖(以橘色(DhMRs在糖足中表達上調)或綠色(DhMRs在糖足中表達下調)表示，橘色表示上調與下調DhMRs總和)

圖 3 35個DhMRs網絡圖

表 2 糖尿病足潰爛組對比健康對照組Hub基因表

2.4GO富集分析對10個Hub基因進行富集分析，在生物過程中(藍色)涉及到VEGFR信號通路、Ras蛋白信號轉導、肌細胞分化的正向調節(jié)以及與免疫相關的白細胞介素12分泌的正向調節(jié)等；在細胞成分中(紅色)，主要與細胞質、胞液等相關；在分子功能中(綠色)，主要有細分化調控、血管內皮生長因子受體信號通路、髓樣細胞分化調控等功能，見圖4。

圖 4 GO富集分析

2.5KEGG通路分析KEGG分析顯示Hub基因主要富集于白細胞跨內皮細胞遷移、有絲分裂原活化蛋白激酶信號通路、血小板激活、T細胞受體信號通路和血管內皮生長因子信號通路等，見圖5。其中血小板激活包括RAP1B、MAPK11、MAPK14；血管內皮生長因子信號通路包括CDC42、MAPK11、MAPK14；有絲分裂原活化蛋白激酶信號通路包括RAP1B、CDC42、MAPK11、MAP3K1、MAPK14。

圖 5 KEGG富集分析

2.6基因表達驗證DFU組MAPK11與 CDC42 mRNA(1.75±0.34、1.21±0.12)明顯高于對照組(1.02±0.14、0.95±0.10)，免疫組化結果表明MAPK11與CDC42表達水平在DFU中更高(P<0.05)，見圖6。

圖 6 組織基因的蛋白表達水平(免疫組化)

3 討 論

DFU是糖尿病一種嚴重的并發(fā)癥，近一半的患者壽命不足5年，死亡率高于某些腫瘤[8]，近年來，隨著對糖尿病創(chuàng)面的關注不斷增加，也有文獻對糖尿病創(chuàng)面愈合的表觀遺傳機制進行了研究，但對于DFU的5hmC表觀遺傳學研究尚不多見[9]。因此，利用5hmC對DFU具有潛在的研究價值。

首先本研究發(fā)現(xiàn)，5hmC在DFU與健康志愿者組織DNA中的5hmC富集有明顯差異，另外，5hmC標志物可以將兩組區(qū)分開。表觀遺傳修飾已被確定為發(fā)生1型糖尿病和2型糖尿病的原因之一，關于糖尿病傷口愈合的表觀遺傳機制的研究已經出現(xiàn)在文獻中，為我們研究提供理論基礎[9-11]。

本研究篩選出428個DhMGs，其中166個基因在DFU患者中發(fā)生高度羥甲基化，并且大部分DhMGs分布在啟動子、內含子和外顯子等基因功能區(qū)。有研究表明，基因體位置發(fā)生高度羥甲基化會促進基因轉錄[6]，所以，對這些DhMGs的深入分析有助于我們探究DFU的發(fā)病機制。進一步地，通過STRING對428個DhMGs進行PPI分析，使用Cytoscape建立基因調控網絡圖，我們篩選出MAPK14、MAPK11、CDC42、MAP3K1、NCOA1、RAP1B、AGO4、RUNX1等10個Hub基因。我們對MAPK11與CDC42 mRNA水平和蛋白水平進行驗證，發(fā)現(xiàn)與5hmC表達水平一致。

MAPK14、MAPK11分別稱為稱為p38-α酶和p38-β酶，均屬于p38 MAPK家族，在細胞受到促炎細胞因子或生理應激等外界刺激下引起的細胞級聯(lián)反應中發(fā)揮重要作用，激活轉錄因子。既往研究中，使用MAPK抑制劑，糖尿病小鼠傷口愈合能力增強[12]，同時還發(fā)現(xiàn)在胃潰瘍患者中，MAPK通路與也被激活[13]。另外，文獻證明，使用全基因組關聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn) MAPK14基因與糖尿病足潰爛相關[14]。與MAPK14同家族的MAPK11，目前雖無MAPK11與糖尿病足潰爛愈合的明確文獻，根據本研究結果提示MAPK11或也可能影響糖尿病足潰爛的愈合。CDC42作為Rho GTPases家族的成員，參與多種細胞功能的調節(jié)，包括細胞周期進程、存活、轉錄、肌動蛋白細胞骨架組織和膜運輸。最近研究表明，CDC42參與胰島素的合成過程，與胰島素抵抗和糖尿病腎病的發(fā)病機制相關，被認為是糖尿病進展過程中的關鍵成員[15]。這與本研究結果一致，CDC42在啟動子區(qū)域富集5hmC表達升高，而在啟動子區(qū)域富集5hmC可以促進基因的轉錄[16]，通過改善CDC42的表達有望成為糖尿病足潰爛治療的方法。

最后，本研究通過 DAVID數(shù)據庫對10個Hub基因進行 GO 功能和 KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，富集到VEGFR信號通路、MAPK信號通路、血小板激活等這些與傷口愈合相關的通路。文獻表明糖尿病患者傷口愈合延遲的一個主要原因是缺氧誘導因子-1α/血管內皮生長因子(HIF-1α/VEGF)軸的功能受損，從而導致對缺氧的反應受損的新血管形成，我們富集出VEGFR信號通路也證明這點[17-18]。成纖維細胞是皮膚的基本細胞類型，高度參與傷口再生過程[19]，有研究對GEO數(shù)據關于糖尿病傷口(GSE49566 和GSE78891)測序結果分析，其富集到最高的通路為MAPK通路，同時在 MAPKAPK3、HSPA2 和 TGFBR1 中確定了糖尿病傷口愈合的調節(jié)作用[20]。

有趣的是我們還富集到中性粒細胞通路、白細胞介素12分泌通路、白細胞跨內皮細胞遷移和T細胞受體信號通路等與免疫相關的通路，提示這些基因與炎癥及免疫系統(tǒng)相關，最近文獻表明免疫在感染性疾病中占有重要地位[21-22]，我們的研究也佐證了這點。研究表明，多形核白細胞(PMNS)，也稱為中性粒細胞，是一組相對較大的白細胞，最為第一道免疫防線的要作用[23]，參與穩(wěn)態(tài)、傷口愈合和組織修復[24]，其與淋巴細胞的比值可以反映炎性的程度[25]，中性粒細胞的招募失調是糖尿病中性粒細胞起到重足潰爛傷口難愈合的原因之一[23, 26]。白細胞遷移可能與向血管損傷部位輸送高反應性促炎和促凝血介質有關[27]。白細胞介素12作為免疫微環(huán)境重要的細胞因子在感染性疾病中被研究[28]，它由M1巨噬細胞分泌，期其分泌的異常與巨噬細胞的狀態(tài)相關，而巨噬細胞的招募與極化對糖尿病傷口潰爛極為重要[29-30], 是其免疫異常的主要原因之一[31]。

綜上所述，本研究通過對DFU患者及健康對照組的組織DNA中5hmC進行測序，發(fā)現(xiàn)大量的DhMGs，通過生物學網絡中節(jié)點的連接和關系來分析網絡特性，得到DFU相關的基因，富集到與免疫與傷口愈合的相關通路，最后得到MAPK11和CDC42可能在DFU發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用，有望成為DFU的治療靶點。