植物黃烷酮-3-羥化酶基因研究進展

段玥彤 王鵬年 張春寶 林春晶

（1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，長春 130033；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長春 130018；3. 大豆國家工程研究中心，長春 130033）

類黃酮（flavonoids）又稱黃酮類化合物，是植物中重要的多酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多種重要的生理功能。大量研究表明，類黃酮控制著植物的花色形成、紫外保護、抵御病原微生物侵染以及與共生微生物的信號作用［1-2］，并具有消炎、抗氧化及清除自由基等多種藥用價值［3-4］。黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是類黃酮代謝途徑上的一個關(guān)鍵酶，可以催化柚皮素發(fā)生反應(yīng)生成二氫黃酮醇，二氫黃酮醇是黃酮醇和花青素合成的共同前體物質(zhì)。因此，F(xiàn)3H基因的表達一方面對植物花色有著重要影響，另一方面影響著植物中黃酮醇的合成途徑。

1 F3H概述

1.1 F3H的發(fā)現(xiàn)

1991年Martin等［5］在研究金魚草（Antirrhinum majus）花色苷合成調(diào)控中，發(fā)現(xiàn)F3H突變會阻斷花青素合成途徑，導(dǎo)致生成白花。之后在矮牽牛（Petunia hybrida）中克隆了F3H基因并在大腸桿菌中進行功能表達［6］?，F(xiàn)今，已經(jīng)從蘋果（Malus pumila Mill.）［7］、葡萄（Vitis vinifera L.）［8］、玉米（Zea mays L.）［9］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）［10］、大豆（Glycine max）［11］、紅花（Carthamus tinctorius L.）［12］、百合（Lilium spp.）［13］等多種植物中克隆得到F3H基因。在大多數(shù)植物體內(nèi)，F(xiàn)3H基因以單拷貝形式存在［9-10］，在大豆、小麥（Triticum aestivum L.）和紫蘇（Perilla frutescens）中則含有2-4個拷貝［14］。

1.2 F3H的結(jié)構(gòu)

黃烷酮3-羥化酶屬于2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-ODD）家族，其基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)都高度保守，具有較強的底物特異性，需要Fe2+和氧化戊二酸等輔助因子來催化反應(yīng)［15］，對F3H的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，包含2-ODD家族特有的保守氨基酸位點組氨酸His218、His276、天冬氨酸Asp220、精氨酸Arg286和絲氨酸Ser288，可以促進F3H的活性［16］。在渝紫薯7號（Ipomoea batatas L.）的F3H基因蛋白中，具有與酮戊二酸結(jié)合的RXS基序Arg287-Ser285，以及能結(jié)合Fe2+的His219、Asp221和His277［17］。通過對白花茶樹（Camellia sinensis）CsF3H、黃花金花茶CnF3H和紅花浙江紅山茶CcF3H三個基因進行序列比對并對其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，除以上位點外，3個F3H蛋白的保守結(jié)構(gòu)域中存在一個差異位點，CcF3H由異亮氨酸Ile200變異為纈氨酸Val200［18］，在茶屬F3H蛋白中Val200相對保守。

2 F3H參與花青素合成的研究

2.1 合成路徑

F3H能夠催化黃烷酮羥基化生成二氫黃酮醇，是花青素生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶［19］。植物花青素合成途徑是類黃酮合成途徑的一個分支，相關(guān)研究較為成熟［20］，可分為3個階段，第一階段為苯丙氨酸（phenylalanine）在苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、肉 桂 酸 羥 化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）催化下生成p-香豆酰輔酶A，同時乙酸（acetic acid）在乙酰輔酶A連接酶（acetyl-CoA ligase，ACL）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）的作用下生成丙二酰輔酶A；第二階段為p-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A受查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）和 查 爾 酮 異 構(gòu) 酶（chalcone isomerase，CHI）調(diào)控，生成柚皮素（naringenin），柚皮素在黃烷酮3-羥化酶的作用下生成二氫山萘酚（dihydrokaempferol，DHK）。然后類黃酮3′-羥化酶（flavonoid 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）和類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）在DHK的不同位點進行羥基化，分別形成二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM）［20］；第三階段為DHK、DHQ、DHM三種產(chǎn)物在二氫黃酮醇4-還原 酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花 青 素苷合成酶（anthocyanidin aynthase，ANS）和類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid-3-O-glucosyltransferase，3GT）的催化作用下形成穩(wěn)定的花青苷；也可以被無色花青素還原酶（leucoanthocyanidins reductase，LAR）和花青素還原酶（anthocyanidins reductase，ANR）催化形成原花青素［21］?；ㄇ嗨夭环€(wěn)定一般以花青苷和原花青素的形式存在。

2.2 調(diào)節(jié)花色

F3H在植物開花期的高表達，將增加花青素的積累，從而影響花朵顏色。在矮牽牛中F3H基因突變失活可阻斷花色素的合成通路，從而產(chǎn)生白花［6］；利用反義RNA技術(shù)對香石竹（Dianthus caryophyllus L.）F3H基因進行抑制，使花色由橙紅色變淡甚至白色，在白色的植株中未能檢測到花色苷的存在［22］；紅、紫、藍色花瓣的荷花（Nelumbo nucifera）中F3H基因的表達量較高，且花瓣由白色變?yōu)榉凵珪rF3H表達量增加［23］；在4種花色滇水金鳳（Impatiens uliginosa）的4個不同花器官發(fā)育時期，IuF3H基因的表達量不同，其中深紅色的始花期表達量最高，粉紅色的盛花期表達量最低［24］。這些研究結(jié)果表明了F3H的表達量與花青素含量的積累密切相關(guān)。

2.3 調(diào)節(jié)果實顏色

F3H在植物成熟期的高表達，將增加花青素的積累，從而影響果實顏色。在梨（Pyrus communis L.）的果色突變體中，隨著果皮顏色變化F3H的表達水平不同［25］；李明等［26］分析了F3H基因在花生（Arachis hypogaea L.）紫色種質(zhì)材料及栽培品種豐花1號中的表達情況，結(jié)果表明花生紫色種質(zhì)材料中AhF3H的相對表達水平明顯高于豐花1號，同花青素含量呈正相關(guān)；在紅穗醋栗（Ribes rubrum L.）果實著色過程中，F(xiàn)3H的表達量隨著果實顏色加深而上升，在著色約75%時表達量達到最高值；在白穗醋栗（R. albrum L.）中F3H表達逐漸下降，且F3H在紅穗醋栗中的表達量高于白穗醋栗［27］；通過RTPCR分析3種不同著色的芒果（Mangifera indica），發(fā)現(xiàn)在紅色的貴妃芒果品種果皮中F3H的表達量最高，其次是黃色的金煌品種，最低的是綠色的桂七品種［28］；利用3種Cas9變體，敲除胡蘿卜（Daucus carota L.）紫色愈傷組織中的F3H基因，阻斷紫色愈傷組織中花青素的生物合成，導(dǎo)致愈傷組織變?yōu)榘咨?9］；與石夏龍眼（Dimocarpus longan Lour.）相比，紅果皮龍眼中F3H等基因顯著上調(diào)，使果皮中積累了花青素，呈現(xiàn)強烈紅色［30］；在草莓（Fragaria × ananassa Duch.）果實成熟過程中FaF3H基因在白果時期的轉(zhuǎn)錄水平較低，全紅時期表達量最高；反義抑制F3H的表達則會阻斷花青素合成代謝，影響果實中花青素積累［31-32］。綜上所述，F(xiàn)3H是否表達以及表達強度是果實花青素合成的關(guān)鍵。

3 F3H參與黃酮醇類合成的研究

3.1 合成路徑

黃酮醇的生物合成是柚皮素在黃烷酮3-羥化酶（F3H）、類黃酮3′-羥化酶（F3′H）或類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）催化下產(chǎn)生不同的二氫黃酮醇。此外，二氫黃酮醇可以在黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）催化下脫氫去飽和形成黃酮醇苷元，在糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）催化下發(fā)生糖基化等修飾，形成結(jié)構(gòu)多樣的黃酮醇衍生物［33］。

3.2 對黃酮類物質(zhì)含量的影響

F3H作用于類黃酮途徑的分叉點，導(dǎo)致產(chǎn)生不同的類黃酮，如黃酮、黃酮醇、花青素和原花青素［34］。F3H的表達量高，可使植物組織中黃酮類物質(zhì)含量的升高。研究發(fā)現(xiàn)，利用反義技術(shù)沉默蘋果MdF3H基因，與野生型相比，黃烷酮的含量增加，但其下游產(chǎn)物的含量降低，表明F3H基因突變抑制了黃烷酮類物質(zhì)向下游代謝物的轉(zhuǎn)化［35］。將番茄（Solanum lycopersicum）SlF3H基因轉(zhuǎn)入煙草（Nicotiana tabacum），結(jié)果表明超表達SlF3H基因的煙草中類黃酮的含量提高，高出野生型約30%［36］。在青蒿（Artemisia annua L.）中，AaF3H基因在黃酮類化合物含量較高的品種中表達量較高，在黃酮類含量較低的品種中表達量較低［37］。此外，Song等［38］發(fā)現(xiàn)超表達枸杞（Lycium chinense）LcF3H的煙草中黃烷-3-醇（兒茶素、表兒茶素）的含量增加。將茶樹CsF3Hs基因轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)在種子中大多數(shù)黃酮醇苷和低聚原花青素的含量顯著增加，表明CsF3Hs在茶樹類黃酮生物合成中起著關(guān)鍵作用［39］。在煙草中導(dǎo)入藤茶（Ampelopsis grossedentata）AgF3H基因過表達載體，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的總黃酮含量提高，最高提高了26.8%［40］。Jan等［41］研究表明OsF3H基因在水稻（Oryza sativa L.）中的過度表達可以顯著增加黃酮類化合物的生物合成。綜上，F(xiàn)3H基因的表達受到抑制或過表達，會直接導(dǎo)致類黃酮代謝合成下調(diào)或上調(diào)。

4 F3H的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

4.1 同其他結(jié)構(gòu)基因共同調(diào)控黃酮類化合物表達

FLS、ANS和F3H都屬于2-ODD類加氧酶家族，在黃酮類化合物的生物合成中都具有重要作用，共同調(diào)節(jié)植物組織中黃酮的積累模式，當煙草NtFLS基因被沉默時，兒茶素、原花青素等花青素含量提高，NtANS基因被沉默時，黃酮醇含量顯著增加，當NtF3H基因抑制時，黃酮醇和花青素含量均降低［42］。將四翅濱藜（Atriplex canescens）AcF3H基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)AcF3H超表達會影響其下游基因DFR和ANS，相比于野生型，AtDFR和AtANS的表達量分別增加了1.9倍和1.8倍，進一步促進黃酮類化合物的合成［43］。

4.2 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控

多個轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控F3H等結(jié)構(gòu)基因。很重要的一類轉(zhuǎn)錄因子是MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）。桃 子（Prunus persica（L.）Batsch）中轉(zhuǎn)錄因子MYB10.1和MYB10.3正向促進了F3H基因的表達［44］。Kee等［45］將來自蘿卜（Raphanus sativus）的轉(zhuǎn)錄因子RsMYB1轉(zhuǎn)入菊花（Chrysanthemum morifolium）中，發(fā)現(xiàn)RsMYB1能夠提高F3H的表達水平，且轉(zhuǎn)基因品系中的花青素含量顯著高于對照組。牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）的MYB類轉(zhuǎn)錄因子PsMYB58過表達煙草，發(fā)現(xiàn)在不同器官中花青素含量積累增加，花青素合成基因相關(guān)結(jié)構(gòu)基因F3H表達也增強［46］。而MYB抑制因子可直接通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因抑制花青素的合成，AtMYBL2通過調(diào)控F3H等表達，進而抑制幼苗期花青素［47］。通過大豆發(fā)根系統(tǒng)，過表達大豆中bHLH（basic Helix-Loop-Helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子GmbHLH3株系中，GmF3H基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，轉(zhuǎn)擬南芥發(fā)現(xiàn)能提高黃酮類物質(zhì)積累［48］。另外，也有其他類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的研究，擬南芥根系中的類黃酮生物合成受GRAS（generally recognized as safe）家族轉(zhuǎn)錄因子SCL3（SCARECROW-LIKE 3）的調(diào)控，在SCL3表達高于正常水平時，F(xiàn)3H顯著增加［49］。F3H/TT6在AtZAT6過表達植物中表現(xiàn)出較高水平［50］。在SRS5（SHI-RELATED sequence 5）過表達植物中，F(xiàn)3H等黃酮/花青素生物合成相關(guān)基因表達下調(diào)［51］。

4.3 外界誘導(dǎo)

環(huán)境因素也能影響F3H基因的表達，全日照白光的光強下，銀杏（Ginkgo biloba L.）幼苗葉片中黃酮醇的含量和F3H表達也最高［52］。UV-B輻射誘導(dǎo)山茶CsF3Hs活性增加，從而增加山茶中黃酮類化合物的積累［53］。以上結(jié)果表明，高等植物UV脅迫能夠誘導(dǎo)F3H等結(jié)果基因的表達，從而提高黃酮類物質(zhì)含量。鄭晟等［54］對檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）分別進行低溫、高鹽以及干旱脅迫處理，CkF3H基因的表達量先升高后降低，且均高于對照水平。在茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）的外部刺激下，CtF3H在醌查爾酮型紅花株（花橙黃色）和黃酮型紅花株（花白色）的轉(zhuǎn)錄組表達呈現(xiàn)截然相反的表達模式［55］。在紅米稻的葉面噴灑FeSO4，F(xiàn)3H的表達上調(diào)，水稻中的原花青素含量顯著增加［56］。HY5（long hypocotyl 5）可以直接結(jié)合許多與花青素生物合成有關(guān)的基因的啟動子，包括CHS和F3H［57］。在20℃/光照條件下處理的李子（Prunus salicina Lindl.）果皮，F(xiàn)3H基因上調(diào)表達，在30℃/黑暗條件下，F(xiàn)3H表達受到抑制［58］。以上研究表明，外界環(huán)境及其他因素的改變，如光照、溫度等，可以提高F3H的表達量，促進黃酮類化合物的生成。

5 展望

F3H基因作為花青素合成途徑和黃酮醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，在許多植物中都已克隆得到。近年來主要研究集中于F3H基因在花色育種、果色形成中的調(diào)控作用，以及非生物脅迫對花色素苷合成的影響［59］。另外在花香基因工程中也有應(yīng)用研究，通過反義抑制黃烷酮-3-羥化酶基因阻礙康乃馨花青素的合成，將代謝轉(zhuǎn)移到苯甲酸途徑，從而苯甲酸甲酯含量提高，使轉(zhuǎn)基因植株花朵香味更濃［22］。目前對植物黃酮類具體化合物含量的研究相對較少，隨著轉(zhuǎn)基因、基因編輯技術(shù)及代謝物測定技術(shù)發(fā)展迅速，今后對重要經(jīng)濟植物的F3H基因進行克隆，并借助基因工程手段進一步了解其調(diào)節(jié)功能，有助于深入研究如何提高植物黃酮類化合物含量；植物次生代謝合成過程極其復(fù)雜，需要各種酶的協(xié)同作用，因此研究F3H基因與其他結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同轉(zhuǎn)化，能更好地調(diào)控轉(zhuǎn)化植株目的次生代謝產(chǎn)物的含量［60］，培育植物新種質(zhì)。另外包括代謝組學(xué)在內(nèi)的多組學(xué)聯(lián)合研究也將是今后研究F3H參與次生代謝基因工程研究的重要生物信息學(xué)手段和方向。