溫度對真眼點藻生長、總脂及二十碳五烯酸（EPA） 合成的影響

許瑾 李濤，，3 李楚琳 朱順妮 王忠銘 向文洲，3

（1. 中國科學(xué)院廣州能源研究所 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點實驗室 中國科學(xué)院可再生能源重點實驗室，廣州 510640；2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室 廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（廣州），廣州 511458）

二十碳五烯酸（C20：5，EPA）是一種人體不能合成但又不可缺少的ω-3長鏈多不飽和脂肪酸，它具有降低膽固醇、預(yù)防心腦血管疾病的功能［1］，此外，它也是許多水生甲殼類動物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)［2］。自然界中許多微藻可以合成EPA，藻細(xì)胞合成的EPA主要存在于膜脂中［3-5］，EPA對藻細(xì)胞具有儲存能量和碳源、清除胞內(nèi)自由基和調(diào)節(jié)膜流動性等作用，對維持藻細(xì)胞生命活動具有重要意義［6］。

微藻細(xì)胞EPA的合成主要有ω-3和ω-6兩種途徑［6］，乙酰輔酶a經(jīng)脂肪酸從頭合成途徑生成C16：0，隨后在鏈延長酶、Δ9和Δ12去飽和酶的作用下，生成C18：2（ω-6）。ω-3途 徑 具 體 為C18：2（ω-6）→C18：3（ω-3）→C18：4（ω-3）→C20：4（ω-3）→EPA，其中涉及的酶依次為Δ15去飽和酶、Δ6去飽和酶、鏈延長酶和Δ5去飽和酶［6］。ω-6途徑具體為C18：2（ω-6）→C18：3（ω-6）→C20：3（ω-6）→C20：4（ω-6）→EPA，涉及的酶依次為Δ6去飽和酶、鏈延長酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶［6］。許多脂肪酸去飽和酶并非以脂酰CoA或脂酰ACP為底物，而是以甘油脂為底物（如磷脂酰膽堿PC、單半乳糖甘油二脂MGDG、雙半乳糖甘油二脂DGDG和磷脂酰乙醇胺PE等），并且甘油酯的合成存在葉綠體與其他膜系統(tǒng)之間復(fù)雜且高度調(diào)控的相互作用［7］，例如，EPA存在于類囊體膜的MGDG和DGDG中，而C16：0合成EPA需經(jīng)鏈延長酶、Δ5和Δ6去飽和酶的催化，鏈延長酶存在胞質(zhì)中，Δ5和Δ6去飽和酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，因此葉綠體外合成的EPA必須穿梭回葉綠體，才能參與MGDG和DGDG合成［8］，對高等植物的研究表明這一穿梭載體可能是PC或者二酰甘油［7］，但對于產(chǎn)EPA微藻，這一過程仍然未被解析。

影響微藻EPA合成的因素主要包括光強、營養(yǎng)鹽、溫度和鹽度等，研究表明低溫有利于微藻多不飽和脂肪酸的合成，而高溫不利于多不飽和脂肪酸的合成［8］。真眼點藻（Eustigmatos sp.）可以積累高含量的EPA受到廣泛關(guān)注，目前該藻已完成了全基因組測序，有望成為EPA研究的新模式物種［9］。溫度作為影響真眼點藻EPA合成的重要因素，目前鮮有報道。本研究以一株自行分離的真眼點藻JHsu-01為材料，設(shè)置高溫（30℃）和低溫（15℃）兩種培養(yǎng)條件，通過測定藻細(xì)胞生長、脂類組成、脂肪酸組成和分布，研究溫度對真眼點藻EPA合成規(guī)律的影響，隨后利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，探究脂肪酸和脂類合成相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，研究結(jié)果為后續(xù)通過基因改造提高真眼點藻EPA產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以真眼點藻（Eustigmatos sp. JHsu-01）為實驗材料，該藻株分離自廣東省韶關(guān)市丹霞山國家公園［10］，現(xiàn)保藏于中國科學(xué)院廣州能源研究所。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 該藻利用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)［11］，培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻細(xì)胞離心后重新懸浮于新鮮BG-11培養(yǎng)基中，初始接種OD750為0.50 ± 0.02，培養(yǎng)容器為500 mL三角燒瓶，置于三溫區(qū)光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為12 d。

設(shè)置2個處理組，分別為高溫處理組（30℃）和低溫處理組（15℃），每個處理組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。光強為300 μmol photons/（m2·s），連續(xù)照明，在培養(yǎng)周期中，每2 d測定生長參數(shù)（生物量和細(xì)胞密度）和光合效率，并收集藻泥利用FD-1-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，中國）進行干燥，并保存在-20℃冰箱中備用。收集第6天藻泥，利用液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存用于轉(zhuǎn)錄組測定。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞密度 使用BX41光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）觀察藻細(xì)胞形態(tài)，并用XB-K-25血球計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司，中國）測定細(xì)胞密度。

1.2.3 生物量 取藻液10 mL過濾到預(yù)先烘好的混合纖維濾膜（重量為m1，g）上，將帶有藻細(xì)胞的濾膜置于80℃烘箱24 h，放置干燥器中冷卻至室溫后稱重（重量為m2，g）。

1.2.4 總脂含量和脂類層析分級 80 mg藻粉加入3 mL 10%二甲亞砜-甲醇溶液，分別于50℃抽提30 min、冰浴抽提30 min后，離心收集上清液于預(yù)先烘干的玻璃小瓶中，藻渣加入乙醚/正己烷6 mL（1∶1，V∶V），冰浴抽提1 h，離心收集上清液至同一玻璃小瓶中，重復(fù)上述過程直到藻渣變白。在合并的抽提液中加入3 mL純水，震蕩分相，移取有機相，并氮氣吹干至恒重，即得總脂含量［12］。

以一定體積的氯仿/甲醇（1∶1，V∶V）溶解總脂，利用500 mg Cleanert Silica硅膠柱（博納艾杰爾科技有限公司，天津）進行總脂層析分級，首先用10 mL的氯仿洗脫得到中性脂（主要為三酰甘油），然后用10 mL丙酮洗脫得到粗糖脂，最后用10 mL甲醇洗脫得到磷脂，收集每一組份于小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮氣吹至較小體積，將濃縮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的1.5 mL 塑料離心管中，用氮氣吹干至恒重，得到不同脂類組分的重量［13］。

1.2.5 脂肪酸組成和含量 稱25 mg藻粉，加入2 mL 2% H2SO4無水甲醇∶甲苯（90∶10，V∶V），充氬氣后，置于80℃的水浴加熱攪拌1.5 h，加入1 mL純水和1 mL正己烷震蕩分層，將上層有機相轉(zhuǎn)移到1.5 mL樣品瓶中，用氮氣吹干，同時加入1 mL碳十七烷酸甲酯，利用氣相色譜進行測定，獲得的脂肪酸峰與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比較，分析獲得其組成和含量。氣相色譜測定條件為DB-5毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm），以高純氮氣為載氣，檢測器為FID檢測器，進樣口溫度260℃，程序升溫（60℃保留2 min→30℃/min升溫至120℃→1.5℃/min升溫至250℃保留2 min）［13］。

1.2.6 光合效率測定 利用脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨xPAM-100（Walz，德國）測定光系統(tǒng)II的實際光量子產(chǎn)量Y（PSII）和調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPQ）。取藻液5 mL，于黑暗處適應(yīng)60 min，測定時，首先打開測量光（8 μmol photons·m-2·s-1）照射30 s， 測得初始熒光F0，隨后開啟飽和脈沖光（4 000 μmol photons·m-2·s-1）照射0.8 s，測得最大熒光Fm，打開光化光（300 μmol photons·m-2·s-1）照射10 min，測得最小熒光強度Fs，再次打開飽和脈沖光 （4 000 μmol photons·m-2·s-1）照 射0.8 s，測 得Fm′，根據(jù)以下公式計算得到Y(jié)（II）和Y（NPQ）。

Y（II）為光系統(tǒng)II的實際光量子產(chǎn)量，F(xiàn)′m為光化光條件下的最大熒光強度，F(xiàn)s為光化光條件下的最小熒光強度，F(xiàn)m為暗適應(yīng)后的最大熒光強度。

Y（NPQ）為光系統(tǒng)II調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量，F(xiàn)′m為光化光條件下的最大熒光強度，F(xiàn)m為暗適應(yīng)后的最大熒光強度。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組分析 （1）RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及測序：利用RNA提取試劑盒提取總RNA，RNA純度和完整性分別利用NanDrop 1000 spectrophotometer（Termo Scientific，USA）和Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，USA）進行檢測。去除rRNA后，利用mRNA Capture Beads富集真核生物mRNA，采用高溫和金屬離子作用實現(xiàn)mRNA的片段化。以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成單鏈cDNA，隨后進行雙鏈cDNA的合成反應(yīng)，再用DNA Clean Beads純化雙鏈cDNA，純化的雙鏈cDNA先進行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，再用DNA Clean Beads進行片段大小分選。最后進行PCR擴增，并用DNA Clean Beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer進行質(zhì)檢。最后，利用Illumina HiSeq2000進行測序。（2）De novo組裝及基因注釋：對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭序列及低質(zhì)量Reads的處理，獲得Clean Data；用短reads組裝軟件Trinity組裝，對組裝獲得的unigene進行BLAST，分別將unigene注釋到NR、Nt、Swiss-Prot、GO、KEGG和COG。（3）差異基因分析：利用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）計算基因表達量。FPKM代表的是每一百萬個能對比上Reads中每kb外顯子的片段數(shù)。錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.001且log2（fold change）＞±1作為篩選條件評價基因的差異性。

1.2.8 統(tǒng)計分析 本文中所有圖表所示的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均由3個生物學(xué)重復(fù)和3個測定重復(fù)計算獲得，利用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析（ANOVA），樣品均值之間的差異用最小顯著性差異（LSD）進行分析，置信度為0.05。

2 結(jié)果

2.1 溫度對真眼點藻生長的影響

真眼點藻JHsu-01在30℃和15℃培養(yǎng)條件下的生長情況如圖1-A和1-B所示，15℃處理組獲得了更高的生物量（0.57 g/L），較30℃（0.48 g/L）提高了18.8%。細(xì)胞密度的變化趨勢與生物量一致，15℃比30℃提高了17.8%。圖1-C和1-D是真眼點藻在30℃和15℃培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明，溫度對真眼點藻JHsu-01的細(xì)胞形態(tài)影響較大，30℃時葉綠體分界不明顯，葉綠體出現(xiàn)片段化，細(xì)胞黃綠色，可見多個大且分散的眼點，眼點呈鮮紅色，15℃處理組，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，周生裂葉狀，細(xì)胞深綠色，存在1-2個眼點，眼點呈暗紅色。

圖1 不同溫度培養(yǎng)下真眼點藻JHsu-01的細(xì)胞形態(tài)及生長特性Fig.1 Cell morphology and growth characteristics of Eustigmatos sp. JHsu-01 cultured at different temperatures

2.2 溫度對真眼點藻光合效率的影響

Y（PSII）表示藻細(xì)胞光系統(tǒng)II的實際光量子產(chǎn)量，如圖2-A所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，30℃條件下，藻細(xì)胞的Y（PS II）均呈現(xiàn)降低趨勢，至培養(yǎng)結(jié)束，Y（PS II）降低幅度達到98.5%，說明30℃培養(yǎng)條件顯著抑制了藻細(xì)胞光系統(tǒng)II的活性。15℃條件下，藻細(xì)胞的Y（PS II）相對穩(wěn)定。Y（NPQ）是光系統(tǒng)II的調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量，如圖2-B所示，30℃條件下，藻細(xì)胞的Y（NPQ）顯著高于15℃，說明藻細(xì)胞在30℃條件下將更多能量用于熱耗散。

圖2 溫度對真眼點藻JHsu-01的PSII的實際光量子產(chǎn)量（A）和PSII的調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（B）的影響Fig.2 Effects of temperature on the effective photochemical quantum yield of PSII（A）and quantum yield of the light-induced non-photochemical fluorescence quenching of PSII（B）of Eustigmatos sp. JHsu-01

2.3 溫度對真眼點藻脂類積累的影響

溫度對真眼點藻JHsu-01油脂含量的影響如圖3-A所示，30℃組從第2天開始總脂含量呈降低趨勢，而15℃組總脂含量逐漸增加，培養(yǎng)結(jié)束時，15℃組的總脂含量為20.3% DW，30℃處理組的總脂含量為16.0% DW。30℃培養(yǎng)條件下，中性脂比例逐漸增加，從初始的40.7% TL（total lipid）增加至62.3% TL，膜脂（糖脂+磷脂）的比例由59.3% TL降低至37.8% TL（圖3-B）；15℃培養(yǎng)條件下，中性脂由40.7% TL增加至46.8% TL，膜脂（糖脂+磷脂）的比例由59.3% TL降低至53.3% TL（圖3-B），上述結(jié)果表明，30℃加速了中性脂的積累，但不利于膜脂的積累，而15℃有利于膜脂的積累，而不利于中性脂的積累。

圖3 溫度對真眼點藻JHsu-01總脂含量（A）和脂類分級（B）的影響Fig.3 Effects of temperature on the total lipid content（A）and lipid classification（B）of Eustigmatos sp. JHsu-01

2.4 溫度對真眼點藻脂肪酸組成的影響

真眼點藻JHsu-01脂肪酸組成的時相變化如圖4所示，C16：0、C16：1、C18：1和C20：5是該藻的主要脂肪酸，30℃培養(yǎng)顯著提高了C16：1的比例，由培養(yǎng)初始的37.6% TFA（total fatty acid）增加至50.4% TFA，15℃培養(yǎng)時，C16：1的比例變化較小（在35.7%-37.6% TFA范圍變化）。30℃條件下，EPA由培養(yǎng)初始的23.8% TFA逐漸降至14.1% TFA，而15℃條件下，EPA的含量穩(wěn)定在27.7%-28.7% TFA，上述結(jié)果表明，15℃有利于EPA的合成，而30℃不利于EPA的合成。

圖4 30℃（A）和15℃（B）培養(yǎng)溫度對真眼點藻JHsu-01脂肪酸組成的影響Fig.4 Effects of 30℃（A）and 15℃（B）on the fatty acid composition of Eustigmatos sp. JHsu-01

2.5 溫度對真眼點藻EPA分布的影響

由圖5-A和5-B可知，30℃培養(yǎng)顯著降低了真眼點藻的EPA含量，藻細(xì)胞EPA含量由2.30% DW（0 d）降低至1.37% DW（12 d），降低幅度達到40.6%（P＜0.01），而15℃條件下，藻細(xì)胞中EPA含量由2.30% DW（0 d）增加至2.78% DW（12 d），增加幅度達到20.86%（P＜0.05），說明15℃比30℃更有利于EPA的合成。進一步測定了不同脂組分的EPA含量（圖5-A和5-B），30℃培養(yǎng)條件下，中性脂的EPA含量變化較小，糖脂和磷脂的EPA含量明顯降低，至培養(yǎng)結(jié)束，糖脂和磷脂的EPA含量分別降低65.44%和69.95%（P＜0.05），上述結(jié)果表明，膜脂中EPA含量的降低是導(dǎo)致EPA總量減低的原因。

為了分析藻細(xì)胞合成EPA后的去向問題，本研究分析了總EPA在中性脂、糖脂和磷脂的比例，由圖5-C和5-D可知，溫度可以影響藻細(xì)胞EPA在不同脂組分間的分布，15℃培養(yǎng)條件下，總EPA在中性脂、糖脂和磷脂中的比例分別為22.0%、62.0%和16.0%（第12天），而30℃培養(yǎng)條件下，總EPA在中性脂、糖脂和磷脂中的比例分別為40.9%、51.4%和8.3%（第12天），30℃培養(yǎng)條件下，EPA在中性脂的比例較15℃增加了85.9%（P＜0.05），而在糖脂的比例較15℃降低了17.1%（P＜0.05），上述結(jié)果表明，15℃條件下，微藻更多的EPA分布在糖脂和磷脂中，而30℃條件下，微藻將更多的EPA分布在中性脂中。

圖5 EPA在中性脂、糖脂和磷脂中的分布Fig.5 Distribution of EPA in neutral lipids，glycolipids and phospholipids

2.6 溫度對真眼點藻脂肪酸代謝相關(guān)通路的影響

測序及注釋：高通量測序獲得Raw Reads經(jīng)過低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾后，得到高質(zhì)量Clean Reads分別為55.1 M（30℃）和49.8 M（15℃），GC含量均超過55%，Q20均大于98%，N堿基比例低于0.01%，表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，可用于進一步的生物信息學(xué)分析；將Clean Reads數(shù)據(jù)de novo組裝獲得參考序列，獲得unigene數(shù)目為106 864個，將unigene與數(shù)據(jù)庫進行比對，共有67 363個成功得到了注釋，注釋率為63.0%。同源物種分布結(jié)果顯示物種相似度最高的5個物種分別為水云（22.4%）、伽得擬微綠球藻（13.1%）、玉米（6.1%）、大豆疫霉菌（6.0%）和抑食金球藻（5.2%）（圖6-A）；E-value分布結(jié)果顯示31.8%的mapped sequences展示出較強的可信度（小于10-45），仍然有68.2%的mapped sequences展示出在10-5-10-45的可信度（圖6-B）；序列覆蓋度結(jié)果顯示相似度大于80%的mapped sequences只有2.7%，其余mapped sequences展示出17-80%的相似度（圖6-C）。

圖6 注釋基因的統(tǒng)計分析Fig.6 Statistical analysis of annotated genes

脂肪酸合成：乙酰輔酶a經(jīng)乙酰CoA羧化酶（ACCase）催化生成丙二酸單酰-ACP，隨后經(jīng)過縮合、還原、脫水和還原4步反應(yīng)進行鏈延長，每循環(huán)一次增加2個碳，4步反應(yīng)分別在3-酮?；?ACP合成酶（fabF）、3-酮酰基-ACP還原酶（fabZ）、3-酮?；?ACP脫水酶（fabG）和烯酯酰ACP還原酶I（fabI）進行，最終合成C16：0和C18：0。結(jié)果顯示accA、fabF、fabG、fabZ、fabI四個基因在15℃條件下均顯著上調(diào)，說明15℃條件下較30℃條件更有利于脂肪酸的合成（圖7和表1）。

脂肪酸去飽和：EPA合成中的3個關(guān)鍵去飽和酶（Δ5、Δ6和Δ15脂肪酸去飽和酶），在15℃條件下，均顯著上調(diào)（圖7和表1），說明15℃條件下較30℃條件更有利于EPA的合成，未注釋到Δ17脂肪酸去飽和酶，因此無法確定ω-6合成途徑是否存在。

硫脂和糖脂合成：SQDG合成中的兩個關(guān)鍵酶硫代異鼠基轉(zhuǎn)移酶（SQD2）和UDP-硫代異鼠糖合酶（SQD1）在15℃條件下均顯著上調(diào)；MGDG和DGDG合成中的兩個關(guān)鍵酶二?；视?-β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（MGD）和二半乳糖二酰基甘油合酶（DGD）在15℃條件下均顯著上調(diào)（圖7和表1），說明15℃條件下較30℃條件更有利于硫脂和糖脂的合成。

磷脂合成：PC、PE和磷脂酰絲氨酸（PS）合成中的3個關(guān)鍵酶CPT1、EPT1和PTDSS2下調(diào)，磷脂酰甘油（PG）的關(guān)鍵酶pgsA和GEP4無顯著性變化，磷脂酰肌醇（PI）合成中的關(guān)鍵酶CDIPT上調(diào)（圖7和表1）。

三酰甘油合成：磷酸二羥丙酮分別經(jīng)3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（GPDH）、甘油磷酸脫氫酶（GPAT）、1-?；视?3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（plsC）、磷脂酸磷酸酶（PLPP）、二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT）合成三酰甘油，其中，GPAT、plsC、PLPP和DGAT在15℃條件下均上調(diào)（圖7和表1），說明15℃條件下較30℃條件更有利于甘油酯的合成。

表1 脂肪酸合成相關(guān)酶基因的變化情況Table 1 Expression changes of genes in lipid and fatty acid biosynthesis pathways

圖7 溫度對真眼點藻JHsu-01脂肪酸代謝通路的變化Fig.7 Changes of temperature on the fatty acid metabolic pathways of Eustigmatos sp. JHsu-01

3 討論

3.1 溫度影響真眼點藻的生長和脂類積累

溫度是影響微藻生長的重要環(huán)境因素之一，針對一些具有生物餌料潛力的微藻，研究溫度的影響尤為重要。本研究表明，真眼點藻JHsu-01在15℃條件下的細(xì)胞密度、生物量和光合效率均高于30℃培養(yǎng)條件，由于該藻株采集自廣東地區(qū)，生境溫度可達30℃以上，但實際上降低培養(yǎng)溫度更有利于其生長。大部分微藻在15-30℃均可以生長，但適宜生長的溫度卻各有不同，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum CCMM2012）、微擬球藻（Nannochloropsis sp. CCMM6004）和 柵 藻（Scenedesmus quadricauda CCMM4002）的適宜生長溫度均為25℃［14］，瑞典四爿藻（Tetraselmis suecica FIKU032）可以在40℃條件下生長［15］。真眼點藻綱共有1目6科13屬28種，它們在淡水、海水和土壤表面等環(huán)境中都有分布［16］，大部分已報道的真眼點藻研究中，培養(yǎng)溫度通常為25℃［17］，具體到真眼點藻綱的某一種類，適宜生長的溫度可能存在較大差異，適宜眼點擬微球藻（Nannochloropsis oculata）生長的溫度為21℃［18］，大洋擬微球藻（Nannochloropsis oceanica）在18-28℃條件下都可以正常生長［19］。本研究重點探究低溫和高溫對真眼點藻JHsu-01多不飽和脂肪酸代謝的影響，對于適宜其生長的具體溫度，則需要更為細(xì)化的溫度梯度實驗進行驗證。

溫度可以影響微藻的脂類合成［20］。真眼點藻JHsu-01在15℃培養(yǎng)條件下獲得了更高的總脂含量，分析脂類組成發(fā)現(xiàn)，15℃條件下總脂含量提高的原因是由于膜脂比例增加引起，膜脂提高通常是微藻增強環(huán)境適應(yīng)性的一種策略。不同種類微藻對溫度的響應(yīng)存在差異，改變小球藻（Chlorella sp. MACC-728）的培養(yǎng)溫度，其油脂含量并沒有顯著變化［21］，四尾柵藻（Scenedesmus quadricauda）在30℃時，脂類積累效率最高［22］，由于脂類合成涉及的酶種類多，因此溫度影響脂類合成的潛在調(diào)控位點可能存在多個，目前對于這一調(diào)控機制仍不清楚。

3.2 溫度影響真眼點藻JHsu-01脂肪酸的組成和EPA的分布

溫度可以影響微藻的脂肪酸組成［20］。研究表明，微藻脂肪酸的不飽和度隨溫度降低而增加，而飽和脂肪酸比例隨溫度升高而增加［20，23］。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律，真眼點藻JHsu-01在30℃時的EPA含量為1.37% DW，而15℃時EPA含量達到2.78% DW，提高幅度達到102.9%，說明15℃比30℃更有利于EPA的合成。利用10、15、20、25和30℃培養(yǎng)三角褐指藻（P. tricornutum MP-2），結(jié)果表明15℃處理組的EPA含量最高［24］；當(dāng)培養(yǎng)溫度由10℃提高到25℃時，菱形藻（Nitzschia paleacea）的EPA相對含量由28.4% TFA降低至18.1% TFA，韋氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）的培養(yǎng)溫度由16℃提高到20℃，其EPA含量明顯降低［25］。低溫有利于EPA合成的原因可能與藻細(xì)胞調(diào)節(jié)膜的流動性有關(guān)，膜脂中不飽和脂肪酸增加，可以保證膜在低溫條件仍具有較好的流動性，從而執(zhí)行正常的生理功能［26］。

溫度可以改變真眼點藻EPA在中性脂、糖脂和磷脂中的分布，低溫使更多的EPA分配在糖脂中，糖脂是類囊體膜的主要成分，分布在糖脂中的EPA增加，預(yù)示著類囊體膜的流動性增加，類囊體膜上的色素蛋白復(fù)合物可以更好的橫向運動，提高光能吸收和傳遞效率。30℃培養(yǎng)使藻細(xì)胞合成的EPA更多的分布在中性脂中，結(jié)合“EPA總量減少”、“膜脂比例降低而中性脂比例增加”這一結(jié)果，我們推測30℃條件下，中性脂的EPA可能有一部分來源于磷脂，藻細(xì)胞中存在磷脂轉(zhuǎn)化為三酰甘油的途徑，這步反應(yīng)在磷脂酰膽堿-二?；视王；D(zhuǎn)移酶（PDAT）催化作用下進行，衣藻的PDAT擁有?；D(zhuǎn)移酶及脂肪酶兩種活性，在膜脂分解的過程中，伴隨TAG的產(chǎn)生，使藻細(xì)胞在各種脅迫條件下更好地生存［27］。

3.3 溫度對脂類相關(guān)代謝通路的影響

轉(zhuǎn)錄組測序可以全面快速地獲得藻細(xì)胞在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息，是一種探究微藻代謝規(guī)律的理想技術(shù)。真眼點藻JHsu-01在15℃培養(yǎng)條件下合成脂肪酸的能力增強，并且合成EPA的3個關(guān)鍵酶基因（Δ15、Δ5和Δ6去飽和酶）上調(diào)，這結(jié)果可以解釋15℃比30℃更有利于EPA的合成。球等鞭金藻（Isochrysis galbana）IgFAD5基因僅在低溫15℃處理6-12 h期間表達水平較高［28］，球等鞭金藻3011的Δ4、Δ5、Δ6、Δ8、Δ9和Δ12在18℃的相對表達量最高［29］，上述結(jié)果與本研究結(jié)果相似，均表明低溫可以誘導(dǎo)一些脂肪酸去飽和酶的表達。

微藻細(xì)胞中存在原核和真核兩種膜脂合成途徑，原核途徑發(fā)生在質(zhì)體內(nèi)，而真核途徑發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，原核途徑合成的膜脂主要有磷脂酰甘油PG、MGDG、DGDG和SQDG，而真核途徑合成的脂類主要有PE、PS、PC和PI等［7］。15℃培養(yǎng)條件下，合成糖脂（MGD和DGD）和硫脂（SQD1和SQD2）關(guān)鍵酶基因的表達上調(diào)，說明低溫條件下，葉綠體膜脂合成旺盛，藻細(xì)胞可能具有更強的光需求。三酰甘油合成中的幾個關(guān)鍵酶基因（GPAT、plsC、PLPP和DGAT）在15℃條件下的表達均上調(diào)，說明TAG合成加強，但15℃條件下的中性脂比例比30℃有所降低，推測上述結(jié)果可能與糖脂與中性脂的合成速率有關(guān)，15℃條件下糖脂合成增強，當(dāng)糖脂合成速率快于TAG合成速率時，就會出現(xiàn)中性脂比例降低的現(xiàn)象，后續(xù)可以通過熒光定量PCR對糖脂和TAG合成通路的關(guān)鍵酶基因更加更準(zhǔn)確的量化分析。

真眼點藻JHsu-01的EPA主要分布在糖脂中，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并不能得出EPA分布在糖脂中原因。大量研究表明，許多微藻合成的EPA同樣分布在糖脂中，如紫球藻［5］、三角褐指藻［4］、微擬球藻［4］等，三角褐指藻84%的EPA存在于糖脂中，而僅有11%的EPA存在于TAG中［4］，紫球藻可以積累占總脂肪酸約47%的EPA，但分布在TAG中的EPA僅有2%［5］，這一分配機制可能與某些酶對特定脂肪酸選擇性有關(guān)，大洋微擬球藻（Nannochloropsis oceanica）中存在的2種類型的DGAT（NoDGAT2J和NoDGAT2K），它們對某一種多不飽和脂肪酸具有偏好性，因此可以調(diào)節(jié)EPA在TAG中的比例［30］。真眼點藻JHsu-01的EPA傾向于分配在糖脂中，推測可能與MGD和DGD對脂肪酸選擇的特異性有關(guān)系，對這一機制更深入的分析，需要借助脂組學(xué)技術(shù)，盡可能多的鑒定脂類分子，并通過生物信息學(xué)分析，獲得它們之間的關(guān)聯(lián)性，進而闡釋EPA分布的內(nèi)在調(diào)控機制。

4 結(jié)論

15℃較30℃更有利于真眼點藻JHsu-01的生長、膜脂和EPA的合成，EPA含量最高達到2.78% DW。溫度可以改變EPA在糖脂和中性脂之間的分布比例，15℃條件下，微藻更多的EPA分布在糖脂和磷脂中，而30℃條件下，微藻將更多的EPA分布在中性脂中。低溫條件下，脂肪酸從頭合成、三酰甘油、糖脂、硫脂和ω-3合成途徑加強。綜上所述，低溫是促進微藻EPA合成的重要條件，同時也是一種獲得高含量糖脂型EPA的理想培養(yǎng)方式。