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    利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立OXTR基因敲除豬胎兒成纖維細胞系

    2022-07-22 03:20:10劉靜靜劉曉蕊李琳王盈楊海元戴一凡
    生物技術(shù)通報 2022年6期
    關(guān)鍵詞:巴馬外顯子自閉癥

    劉靜靜 劉曉蕊 李琳 王盈 楊海元 戴一凡

    (南京醫(yī)科大學江蘇省異種移植重點實驗室,南京 211166)

    自閉癥是一種嚴重的神經(jīng)發(fā)育疾病,臨床表現(xiàn)為社會交往障礙、語言交流障礙和刻板重復(fù)的行為方式[1]。自閉癥致殘率較高,且患病率有逐年增長的趨勢,但尚未開發(fā)出特異性的治療藥物,給患者和社會帶來沉重的負擔。自閉癥病因和發(fā)病機制十分復(fù)雜,目前受到關(guān)注最多的是催產(chǎn)素系統(tǒng)假說。催產(chǎn)素是一種具有高度保守結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽,大量的動物實驗表明它與情感反應(yīng)和社會認知等社會行為有關(guān)。催產(chǎn)素的生理作用是通過其唯一的受體OXTR來介導(dǎo)的。人類催產(chǎn)素受體(OXTR)屬于I類G蛋白偶聯(lián)受體,位于3p25-3p26.2,由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成[2]。催產(chǎn)素受體分布在杏仁核、紋狀體、海馬等調(diào)節(jié)社會認知的重要區(qū)域[3-4]。OXTR基因變異可引起大腦結(jié)構(gòu)改變并與社會行為相關(guān)聯(lián),如下丘腦和杏仁核的病變以及社交缺陷等[5-8]。研究表明OXTR基因變異與自閉癥存在相關(guān)性,但催產(chǎn)素受體影響自閉癥的分子機制還不明確。

    OXTR基因敲除的動物模型是揭示OXTR生理功能的重要工具。目前,已有OXTR基因敲除的小鼠、斑馬魚被用于自閉癥相關(guān)行為缺陷的研究[9-10],但它們存在社交信號(發(fā)聲、面部表情)和大腦活動模式有限等缺陷[11]。選擇更理想的自閉癥動物模型顯得尤為迫切。豬和人生理特征和解剖結(jié)構(gòu)更為相近,基因組大小相近、基因數(shù)量和結(jié)構(gòu)類似[12-13]。豬大腦回旋類似于人的新皮質(zhì)且它們灰質(zhì)和白質(zhì)的分布相似[14-15]。此外,豬的快速繁殖期(性成熟5-6個月)和大窩產(chǎn)仔數(shù)(平均7-8頭仔豬),在構(gòu)建人類疾病模型方面比非人類靈長類動物具有明顯優(yōu)勢。然而,目前還未見OXTR基因敲除豬報道,限制了在豬上開展關(guān)于OXTR對于社會認知影響的實驗研究。

    近年來,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展極大推動了創(chuàng)建基因編輯豬疾病模型的研究[16-17]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OXTR基因敲除的巴馬公豬PFFs細胞系,為構(gòu)建OXTR基因編輯豬模型進而深入研究遺傳性自閉癥的發(fā)病機制和防治策略奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    原代巴馬豬胎兒成纖維細胞由本組實驗室提取培養(yǎng)。DH5α感受態(tài)細胞和質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,pX330質(zhì)粒(Addgene 42230)、Bbs I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自美國New England Biolabs 公司,細胞電轉(zhuǎn)儀購自德國Lonza公司,DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、G418藥物均購自美國Gibco 公司,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 人/豬OXTR的同源性分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找并下載人和豬等多個物種的OXTR的氨基酸序列,利用MEGA-X軟件中鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,自展分析1 000次用于檢測系統(tǒng)進化樹的穩(wěn)定性。在線工具 iTOL(https://itol.embl.de/)進一步繪制系統(tǒng)進化樹。

    1.2.2 人/豬OXTR的結(jié)構(gòu)分析 采用DNAMAN軟件、DNASTAR軟件對人/豬OXTR的一級、二級結(jié)構(gòu)進行分析,使用BLAST中的Global Align程序計算一致性和相似性,Chou-Fasman算法預(yù)測人/豬OXTR的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角的比例。接著利用Swiss Model在 線 工 具(https://www.swissmodel.expasy.org/)對人/豬OXTR三維結(jié)構(gòu)進行建模,采用PyMOL軟件比較兩者蛋白結(jié)構(gòu)的相似度。

    1.2.3 豬OXTR關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)域的鑒別 利用NCBI當中的CD-search工具搜索鑒定豬OXTR關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)域。輸入豬OXTR氨基酸序列,同時在右方OPTIONS中選擇數(shù)據(jù)庫選擇具有保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(conserved domain database,CCD庫),提交完成后搜索匹配結(jié)果。

    1.2.4 sgRNA靶點設(shè)計 根據(jù)GenBank中公布的豬的OXTR基因序列(NC_010455.5),設(shè)計引物(表1),并提取巴馬豬PFFs基因組DNA進行PCR擴增,測序驗證是否與公布的基因序列相符。利用在線工具CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)針對第2外顯子區(qū)篩選關(guān)鍵靶向位點,設(shè)計Oligo合成。

    表1 OXTR基因exon 2序列擴增引物Table 1 Amplification primers for exon 2 sequene of OXTR gene

    1.2.5 CRISPR/Cas9打靶載體構(gòu)建 用T4 DNA連接酶將Oligo退火形成的雙鏈二聚體與Bbs I酶切的pX330骨架質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞,均勻涂布于Ampicillin抗性的LB瓊脂培養(yǎng)板上。挑取單菌落進行測序鑒定,擴增鑒定連接成功的菌液,并用質(zhì)粒抽提試劑盒提取。

    1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇凍存的野生型巴馬豬原代PFFs,用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞長滿皿底90%左右轉(zhuǎn)染。利用核轉(zhuǎn)染儀將打靶載體1 μg及Neomycin抗性質(zhì)粒(由本實驗室構(gòu)建)2 μg共轉(zhuǎn)染至野生型PFFs,核轉(zhuǎn)染程序設(shè)定U-023。

    1.2.7 單細胞克隆的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)染24 h后,用含有G418藥物的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d左右,可見G418抗性單細胞克隆形成。用克隆環(huán)挑選狀態(tài)佳的單克隆,轉(zhuǎn)移至24孔板。第2天用含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng),直至細胞長滿皿底,胰酶消化并傳代至12孔板,待12孔板中的細胞長滿后,即可凍存?zhèn)溆?;遺留在24孔板中的細胞長滿后用NP40裂解,裂解程序60℃,60 min;95℃,10 min,以裂解產(chǎn)物為模板PCR,并將產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

    2 結(jié)果

    2.1 人/豬OXTR生物信息學分析

    系統(tǒng)進化樹分析顯示,豬的OXTR進化距離與人接近(圖1)。經(jīng)DNAMAN比對分析,人/豬OXTR氨基酸序列高度一致(一致性/Identity=91%;相似性/similarity=93%)(圖2-A)。利用DNASTAR軟件Protein模塊中對人和豬OXTR的二級結(jié)構(gòu)進行分析,Chou-Fasman算法預(yù)測人OXTR的α螺旋占30.3%,β折疊占40.6%,β轉(zhuǎn)角占21.6%,豬OXTR的α螺旋占42.2%,β折疊占37.7%,β轉(zhuǎn)角占19.3%(圖2-B)。人和豬OXTR具有相似排布和占比的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角。而人和豬OXTR三維建模顯示也具有極高相似度的三維空間排列,RMSD值為0.009(圖2-C)。以上生物信息學分析表明,人/豬OXTR序列和結(jié)構(gòu)具有高度的同源一致性,推測人/豬OXTR具有相似的生物學功能。

    圖1 不同物種OXTR序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of OXTR sequences of different species

    圖2 人/豬OXTR的一級、二級、三級結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of primary,secondary,and tertiary structures of OXTR between humans and pigs

    2.2 豬OXTR關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的鑒別和靶點區(qū)域的選擇

    在CD-search的CDD分析中,鑒別出豬OXTR的7個α螺旋結(jié)構(gòu)域,分別是41-67,74-101,112-142,152-173,197-226,270-300,310-335間的氨基酸殘基(圖3)。研究發(fā)現(xiàn),人類OXTR的7個α螺旋結(jié)構(gòu)域中,第2-5個跨膜結(jié)構(gòu)域與底物的相互作用有關(guān),其中第2個跨膜結(jié)構(gòu)域還與受體的激活相關(guān)[18]。豬OXTR的第2-5個跨膜結(jié)構(gòu)域由豬OXTR的第2外顯子編碼。因此,本研究選擇豬OXTR的第2外顯子作為敲除的靶點位置。

    圖3 豬OXTR關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)域的鑒別Fig. 3 Identification of domains and key residues of porcine OXTR

    2.3 CRISPR/Cas9打靶載體的構(gòu)建

    針對巴馬豬OXTR基因第2外顯子序列,設(shè)計了2對sgRNA oligos(表2、圖4-A)。測序結(jié)果顯示,Oligo退火形成的雙鏈sgRNA-1、sgRNA-2成功插入線性化的pX330骨架質(zhì)粒中(圖4-B-D),并用試劑盒成功提取打靶載體質(zhì)粒。

    圖4 OXTR基因靶點和重組載體測序Fig.4 Target of OXTR gene and sequencing of recombinant vectors

    表2 OXTR基因靶向位點的sgRNA寡核苷酸序列Table 2 Oligonucleotide sequences of sgRNAs at OXTR targeting sites

    2.4 OXTR基因敲除細胞系的鑒定

    將靶向豬OXTR的CRISPR/Cas9質(zhì)粒和Neomycin抗性表達載體共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞,通過G418(1 mg/mL)篩選,獲得到了抗性的單克隆細胞系。提取抗性的單克隆細胞的基因組DNA,PCR擴增OXTR靶點區(qū)域片段后進行測序,并與野生型豬OXTR基因序列進行比對。結(jié)果顯示共獲得了5個純合的OXTR雙等位基因敲除的細胞克隆,其基因型可分為3種類型,在OXTR的靶點區(qū)域產(chǎn)生了411 bp的缺失(mutant type 1),412 bp的缺失(mutant type 2),289 bp的缺失和289 bp的插入(mutant type 3)(圖5,表3)。

    表3 OXTR 敲除PFFs的基因型Table 3 Genotypes of OXTR-knockout PFFs

    圖5 OXTR敲除PFFs的測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of OXTR-knockout PFFs

    3 討論

    自閉癥是一種極其復(fù)雜的疾病,與遺傳、環(huán)境等多種因素密切相關(guān)。雙生子研究證實遺傳因素是影響自閉癥的重要因素[19]。全基因組測序確定OXTR基因是自閉癥的候選基因[20]。催產(chǎn)素受體作為神經(jīng)通路的重要環(huán)節(jié),其異??赡茉斐杉毎麅?nèi)鈣離子濃度變化,導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損,進而影響社會認知功能[21]。因此,OXTR基因與自閉癥存在高度相關(guān)性。由于自閉癥涉及多種復(fù)雜的高級神經(jīng)活動,要為自閉癥研究和治療提供更有利支持,更高級的OXTR基因敲除動物模型非常必要。豬被認為是理想的人類疾病動物模型,因此,本研究選擇用豬胎兒成纖維細胞的OXTR基因進行編輯。

    豬OXTR基因位于第13號常染色體上,生物信息學分析提示,豬OXTR基因突變后可能產(chǎn)生和人類似的遺傳效應(yīng)和病理表型。sgRNA原則上可以設(shè)計在任何外顯子區(qū)域,對目標序列進行切割,通過DNA自身修復(fù)機制引入突變導(dǎo)致基因的敲除。由于在OXTR受體基因的5′上游區(qū)域存在許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,這些位點在調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)錄發(fā)揮主要作用[22],結(jié)合對豬OXTR關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的分析,本研究在第2外顯子選擇靶基因的識別序列,設(shè)計并合成sgRNA。CRISPR/Cas9優(yōu)勢在于操作簡單、實驗周期短、成本低。本課題組已利用此技術(shù)成功構(gòu)建色氨酸羥化酶2(Tph2)基因敲除豬、OSBPL2敲除豬等[23-24],驗證了CRISPR/Cas9技術(shù)在豬基因組修飾上的有效性。我們前期研究中選擇單個sgRNA進行基因打靶,獲得的細胞克隆多數(shù)為靶點區(qū)域產(chǎn)生小片段插入缺失,且敲除的效率相對較低[25]。本研究設(shè)計2個靶向OXTR的sgRNA進行打靶。結(jié)果顯示,5個OXTR雙等位基因敲除的單細胞克隆均在預(yù)期的靶點位置發(fā)生了大片段的堿基缺失或插入,確保OXTR蛋白被完全破壞,表明利用2個sgRNA同時進行基因打靶能夠顯著提高基因敲除的效率。

    據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,全球自閉癥病患病率為6.25%,男性患病率約為女性的4倍。我們推測OXTR突變的雄性巴馬豬更有可能出現(xiàn)自閉癥的病理表型,因此本研究中我們僅對雄性的巴馬豬胎兒成纖維細胞進行了OXTR基因的打靶。本研究中獲得的OXTR基因敲除的巴馬豬胎兒成纖維細胞后續(xù)將用作SCNT(somatic cell nuclear transfer)的核供體細胞,通過胚胎移植構(gòu)建OXTR敲除巴馬豬疾病動物模型。

    4 結(jié)論

    本研究基于CRISPR/Cas9基因編輯工具在巴馬公豬成纖維細胞系上高效實現(xiàn)了OXTR基因的打靶,成功構(gòu)建了OXTR基因敲除的成纖維細胞系,為建立OXTR敲除的豬模型提供了實驗材料。

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