SXZG藥物對(duì)去卵巢大鼠髁突OPG及OPGL表達(dá)的影響

從叢，魏霞臻

（1.長安大學(xué)醫(yī)院，陜西西安 710064；2.西安交通大學(xué)陜西天奎生物醫(yī)藥科技有限公司，陜西西安 710061）

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征是一類病因尚未完全清楚而又有相同或相似臨床癥狀的一組疾病的總稱，可伴有顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)疼痛、下頜運(yùn)動(dòng)異常、關(guān)節(jié)彈響及功能性障礙等癥狀[1]。研究證實(shí)，顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨是雌激素作用的靶組織，雌激素在顳下頜關(guān)節(jié)的生長發(fā)育及顳下頜關(guān)節(jié)紊亂的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥可以造成顳下頜關(guān)節(jié)骨退行性病變[2-4]。

本研究中的試驗(yàn)藥品SXZG藥物是以沙棘油脂肪酸為主成分的中藥組方制備成的中藥軟膠囊劑，其主要成分含十六碳酸、十六碳烯酸、十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、十八烷酸等飽和/不飽和脂肪酸。前期研究證實(shí)SXZG藥物可以降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病概率，但是其對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)髁突有何影響目前還沒有研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立SD大鼠骨質(zhì)疏松模型，制作大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突部免疫組化染色切片來觀察SXZG藥物對(duì)髁突中骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）及骨保護(hù)素配體（Osteoprotegerin Ligand，OPGL）表達(dá)的影響，初步研究SXZG藥物對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠顳下頜關(guān)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD雌性大鼠70只，其中8月齡60只，3月齡10只，購自北京醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0004]，質(zhì)量 290±20 g。

1.2 材料與試劑

SXZG，批號(hào)20110312，西安交通大學(xué)天奎生物醫(yī)藥科技有限公司；己烯雌酚，批號(hào)20100920，合肥久連制藥有限公司；仙靈骨葆膠囊，批號(hào)110784，貴州同濟(jì)堂制藥有限公司；OPG多克隆抗體及OPGL多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，上?？婆d生物科技有限公司；2%戊巴比妥鈉，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；4%甲醛，天津市大茂化學(xué)制劑廠；EDTA，0.5 mol/L，廣州化學(xué)試劑廠；二甲苯，天津市大茂化學(xué)制劑廠；PBS，0.01 mol/L，上?；瘜W(xué)試劑三廠；枸櫞酸鈉緩沖液，0.01 mol/L，天津市大茂化學(xué)制劑廠；3%過氧化氫，廣州化學(xué)試劑廠；山羊血清，北京中杉金橋有限公司；蘇木素，北京化學(xué)試劑公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HHWCu600型恒溫水浴箱，上海醫(yī)療器械廠；S-WSH型超純水儀，美國Millipore；SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡，德國Leica；QDR—4500A型骨密度測定儀，美國HOLOGIC。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建模實(shí)驗(yàn)

在60只8月齡SD大鼠中隨機(jī)選取50只，將2%戊巴比妥鈉以40 mg/kg的劑量注射入大鼠腹腔進(jìn)行全麻，置于俯臥位固定，在背部1/3處剪毛備皮，沿背部正中線向下作一個(gè)縱形切口，切開皮膚及皮下組織，沿肩胛分別于左右兩脅下剪開腰肌，暴露出卵巢及子宮角，將雙側(cè)卵巢完整摘除，術(shù)后分層縫合肌肉及皮膚。剩余10只8月齡SD大鼠作為假手術(shù)組，全麻后打開腹腔，暴露子宮與卵巢，但并未將其切除，直接縫合。手術(shù)3個(gè)月后，在50只去勢大鼠中隨機(jī)抽取10只，與假手術(shù)組的10只大鼠比較，用骨密度測定儀檢測大鼠腰椎、脛骨、股骨的骨密度，檢測結(jié)果顯示去勢大鼠腰椎、脛骨、股骨三個(gè)部位的骨密度均較假手術(shù)組下降（P＜0.05），說明骨質(zhì)疏松模型建模成功。

1.4.2 分組及給藥

建模成功后，將50只去勢大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，灌服不同的藥物，即SXZG劑量1組、SXZG劑量2組、己烯雌酚片組（陽性對(duì)照）、仙靈骨葆膠囊組（陽性對(duì)照）和空白乳劑組；另外2組為假手術(shù)組和青年對(duì)照組（3月齡大鼠），喂服空白乳劑。大鼠連續(xù)灌藥3個(gè)月后，按組別處死，解剖分離出下頜骨。

1.4.3 制作免疫組化染色切片

將大鼠下頜骨置于4%甲醛中固定一周，固定后將下頜骨放入EDTA脫鈣液中充分脫鈣8周，包埋，將髁突區(qū)域石蠟包塊用切片機(jī)制作4～5 μm厚的切片，68 ℃烤片20 min后二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS沖洗5 min×3次；枸櫞酸鈉緩沖液中微波爐內(nèi)加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗5 min×3次；3%過氧化氫37 ℃孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；吸水紙吸去切片上多余的水分，滴加正常山羊血清進(jìn)行封閉，室溫孵育10 min。傾去切片上的血清，滴加一抗（兔抗鼠）工作液，4 ℃過夜；室溫下復(fù)溫30 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加二抗（羊抗兔）工作液，37 ℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；DAB顯示劑顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，之后自來水充分沖洗，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，梯度酒精脫水后，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用激光掃描共聚焦顯微鏡給所有免疫組化切片照相，每個(gè)切片取3個(gè)視野。OPG和OPGL免疫組化結(jié)果以胞漿呈棕黃色染色為陽性表達(dá)，利用MOTIC Med 6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)測定每個(gè)視野的免疫組化染色灰度值，計(jì)算出平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 下頜骨髁突免疫組化染色觀察

顯微鏡下可見OPG及OPGL在大鼠髁突軟骨的全層均可表達(dá)，在軟骨下骨組織中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及骨小梁邊緣的骨細(xì)胞中有不同程度表達(dá)，結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠髁突中OPG和OPGL的表達(dá)

2.2 各組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突中OPG及OPGL表達(dá)灰度值比較

計(jì)算髁突中OPG及OPGL免疫組化染色灰度值，其數(shù)值越大，表示細(xì)胞因子表達(dá)的量越小。與假手術(shù)組相比，去勢組大鼠髁突中OPG表達(dá)明顯減少（P＜0.05），而OPGL的表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；SXZG劑量1組、SXZG劑量2組大鼠髁突中OPG的表達(dá)均較去勢組增多（P＜0.05），OPGL陽性表達(dá)均較去勢組減少；SXZG劑量1組、SXZG劑量2組與假手術(shù)組相比，髁突中OPG的陽性表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05），OPGL表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）；己烯雌酚片組及仙靈骨葆膠囊組大鼠髁突中OPG表達(dá)均較去勢組增加（P＜0.05），OPGL的表達(dá)較去勢組降低（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠髁突OPG及OPGL表達(dá)灰度值比較

在口腔臨床中，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征是一種較為常見的疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂、骨關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎及周圍軟組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與絕經(jīng)期女性體內(nèi)雌激素水平下降有關(guān)，雌激素的缺乏可導(dǎo)致絕經(jīng)期婦女骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[5]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病屬于顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征（Temporomandibular Disorders，TMD）分類中的常見類型，是一種非感染性、非炎癥性的退行性關(guān)節(jié)病變[6]。雌激素對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞有一定調(diào)節(jié)作用，絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平降低導(dǎo)致骨形成速率降低，使骨吸收高于骨形成，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[7]。然而，在骨質(zhì)疏松的進(jìn)展過程中，如何防止髁突軟骨及軟骨下骨組織隨之發(fā)生改變，目前國內(nèi)相關(guān)研究較少[8]。

OPG-OPGL-RANK（核因子-κB受體活化因子，Receptor Activator of NF-κB）系統(tǒng)是聯(lián)系軟骨與軟骨下骨的一條重要路徑，OPG與OPGL的比例對(duì)軟骨下骨組織的重建起到?jīng)Q定性作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞可分泌OPG與OPGL，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織中均有OPG與OPGL的表達(dá)，與骨關(guān)節(jié)炎的形成及關(guān)節(jié)旁骨丟失密切相關(guān)[10]。目前認(rèn)為OPG是抑制破骨細(xì)胞最有效的細(xì)胞因子，其對(duì)破骨細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)在可抑制破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，使得真正具有溶骨功能的破骨細(xì)胞數(shù)量減少，從而達(dá)到保護(hù)骨組織的作用。實(shí)驗(yàn)顯示，OPG可以增加骨密度及骨小梁數(shù)目，控制鈣的吸收，還可以通過抑制破骨細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成來抑制骨吸收[11]。有學(xué)者認(rèn)為，OPGL是唯一能直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育并使破骨細(xì)胞激活且可以抑制破骨細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子[12]。骨組織中OPGL的受體為RANK，主要表達(dá)在破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上，OPGL可通過與RANK的結(jié)合來激活NF-κB和c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal Protein Kinase，JNK），從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，增加成熟破骨細(xì)胞的活性，阻止破骨細(xì)胞的凋亡，但OPGL的上述作用可被OPG競爭性地抑制，因?yàn)镺PG能競爭性地結(jié)合OPGL或阻斷OPGL與RANK的結(jié)合[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，去勢組大鼠在切除卵巢后，下頜骨髁突中OPG表達(dá)明顯減少，而OPGL表達(dá)明顯增多，說明大鼠摘除卵巢后，髁突骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)，而骨形成減弱；在經(jīng)SXZG治療后，大鼠下頜骨髁突中OPG陽性表達(dá)較去勢組增多，而OPGL陽性表達(dá)較去勢組減少，說明SXZG可以增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠髁突的成骨作用，并抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠髁突骨組織的骨吸收活動(dòng)。

3 結(jié)論

通過摘除大鼠卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，將造模成功的雌性SD大鼠采用不同藥物灌胃治療后發(fā)現(xiàn)，SXZG可通過調(diào)節(jié)髁突中成骨細(xì)胞因子OPG及破骨細(xì)胞因子OPGL表達(dá)的比例來影響顳下頜關(guān)節(jié)髁突的骨代謝，從而改善去卵巢大鼠因雌激素水平下降導(dǎo)致的髁突部骨組織丟失。