包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測方法的比較分析

慕妮，何薛純，樊青青，胡雨，陳丹丹

（南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇南通 226006）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏逐漸加快，包裝飲用水因其方便快捷的特性越來越受到人們的喜歡，其安全性（尤其是微生物指標(biāo)）受到格外的關(guān)注[1],但桶裝飲用水微生物項目不合格在日常監(jiān)督檢測中占不合格總數(shù)80%以上[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》（GB 19298—2014）中規(guī)定了銅綠假單胞菌的限量要求為5個包裝中均不得檢出，但該菌對包裝飲用水生產(chǎn)過程中經(jīng)常使用的臭氧、紫外、二氧化氯等消毒手段有一定的抗性[3-4]，就會導(dǎo)致水中原有的銅綠假單胞菌很難被徹底殺滅，造成產(chǎn)品不合格。另外，企業(yè)剛生產(chǎn)的包裝飲用水中銅綠假單胞菌含量可能極低，但由于其保質(zhì)期較長，該菌在運(yùn)輸銷售環(huán)節(jié)中可以增殖至104CFU/mL，也會造成產(chǎn)品不合格[5]。

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陰性條件致病菌，可在水中存活[6-8]。近幾年我國多地市均有包裝飲用水中檢出銅綠假單胞菌的報道[9-12]，其檢出率高達(dá)25.58%[13]，是導(dǎo)致食物中毒的一種因素[14-15]。銅綠假單胞菌會導(dǎo)致人體出現(xiàn)急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥以及嬰兒腹瀉等疾病，對抵抗力低下者及嬰幼兒具有較大的危害性，同時其耐藥性也比較強(qiáng)，因此如何快速而準(zhǔn)確地檢測出水中銅綠假單胞菌對保障人民飲水安全具有重要的意義。

GB 19298—2014標(biāo)準(zhǔn)中銅綠假單胞菌限量要求為n=5、c=0、m=0，即每批次樣品要求檢驗5個包裝且均未檢出銅綠假單胞，該批次樣品才被判定為合格產(chǎn)品，一旦有可疑的菌落出現(xiàn)便需要作進(jìn)一步的鑒定工作。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，檢測銅綠假單胞菌的方法也越來越多，本文通過對幾種檢測鑒定方法進(jìn)行比較分析，旨在對銅綠假單胞菌的快速分離及準(zhǔn)確鑒定提供參考。

1 銅綠假單胞菌檢測方法

1.1 國標(biāo)法

目前實驗室檢測水中銅綠假單胞菌主要采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）的傳統(tǒng)方法。無菌操作量取250 mL的水樣通過孔徑0.45 μm的濾膜，后將該濾膜向上貼于CN瓊脂平板上36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落顏色。藍(lán)色或綠色的菌落，進(jìn)行綠膿菌素確證性試驗，該試驗為陽性則可判斷為銅綠假單胞菌陽性。產(chǎn)熒光（非藍(lán)/綠）和紅褐色的菌落要先接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化后進(jìn)行產(chǎn)氨試驗，挑取紅褐色菌落的純培養(yǎng)物進(jìn)行氧化酶測試和熒光試驗。產(chǎn)氨試驗為陽性則判斷產(chǎn)熒光（非藍(lán)/綠）的菌落為銅綠假單胞菌陽性，而產(chǎn)氨試驗、氧化酶試驗和熒光試驗均為陽性，則判斷紅褐色菌落為銅綠假單胞菌陽性。其他顏色的菌落則直接判斷為非銅綠假單胞菌[16]。

1.2 微生物鑒定系統(tǒng)法

微生物鑒定系統(tǒng)，是一類依據(jù)菌種生理生化特性，并結(jié)合比色、熒光檢測、比濁動態(tài)分析等技術(shù)手段的半自動化或自動化鑒定系統(tǒng)[17]，目前使用較多的微生物鑒定系統(tǒng)主要有VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)、BD PHOENIX M50全自動微生物鑒定系統(tǒng)、API 20E腸桿菌和其他革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)。該方法前期需要按照國標(biāo)法通過過濾的手段將細(xì)菌富集到CN瓊脂平板上，再挑取可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行純化，培養(yǎng)時間一般為24 h。挑取純化后的菌落制成適宜濃度的菌懸液，接種于革蘭氏陰性鑒定板進(jìn)行上機(jī)分析。

1.3 16S rRNA基因序列分析法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)基因分型方法不斷增多，其中16S rRNA基因測序法從遺傳物質(zhì)和分子水平上對微生物進(jìn)行鑒定，鑒定技術(shù)獲得普遍認(rèn)可，該測序技術(shù)應(yīng)用也越來越廣泛[18]。16S rRNA為核糖體RNA的一個亞基，存在保守區(qū)和可變區(qū)，保守區(qū)反映了生物物種間的親緣關(guān)系，可變區(qū)體現(xiàn)物種間的特異性。在利用16S rRNA基因序列分析法進(jìn)行鑒定時，需要利用濾膜上富集的特征或可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂上，再挑取營養(yǎng)瓊脂上的單個菌落接種到液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)18 h后提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測，然后測定序列，并對16S rRNA基因序列進(jìn)行分析與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]，從而對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.4 LAMP檢測法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-meditated Isothermal Amplification，LAMP）是一種通過優(yōu)化改良的等溫基因擴(kuò)增方法[20]，該技術(shù)核心在于設(shè)計一組具有4個以上特異性的引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，在65 ℃左右的恒溫條件下，在1 h內(nèi)完成相應(yīng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，來識別目的基因的6個特定區(qū)域[21-22]。LAMP檢測法鑒定包裝飲用水中的銅綠假單胞菌：首先，將富集在CN瓊脂平板上的菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化；其次，提取細(xì)菌基因組DNA，針對銅綠假單胞菌的基因序列設(shè)計合成引物；最后，按照LAMP擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過濁度法、熒光檢測法或瓊脂糖凝膠電泳法鑒定[23]。

1.5 酶底物法

銅綠假單胞菌利用Pseudalert中豐富的氨基酸、維生素以及其他營養(yǎng)物質(zhì)快速生長和增殖，而且產(chǎn)生一種水解酶，底物經(jīng)酶水解后在366 nm紫外燈下產(chǎn)生藍(lán)色的熒光，以此對銅綠假單胞菌進(jìn)行鑒定[24]。該技術(shù)不需要用純的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行試驗，只需將包裝飲用水樣品直接與含酶底物Pseudalert試劑的稀釋液充分混勻后，倒入97孔無菌定量盤內(nèi)；用封口機(jī)封口后置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；在暗處用波長為366 nm的紫外燈照射定量盤，有黃色反應(yīng)且有藍(lán)色熒光反應(yīng)的空穴則表示有銅綠假單胞菌。然后可對照《97孔定量盤法不同陽性結(jié)果的最可能數(shù)MPN及95%可信范圍》表查出其最可能數(shù)，結(jié)果以MPN/100 mL表示，達(dá)到快速定量的目的[25]。

1.6 MALDI-TOF MS法

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF MS）是一種將質(zhì)荷比不同的運(yùn)動離子（如帶電荷的核酸、蛋白質(zhì)等）通過電場和/或磁場，加速通過飛行管道后，根據(jù)達(dá)到檢測器的時間及離子數(shù)量而形成相應(yīng)的峰圖的檢測方法。微生物是由不同的特異蛋白質(zhì)組成，不同的蛋白質(zhì)通過MALDI-TOF MS會獲得種屬間的特異峰圖，將其與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中的參考圖譜進(jìn)行比對，得到最為匹配的幾種菌種并給出相應(yīng)的鑒定分?jǐn)?shù)，進(jìn)而得到最終的鑒定結(jié)果[26]。同樣，MALDI-TOF MS法鑒定包裝飲用水中的銅綠假單胞菌也需要將水樣過濾富集到CN瓊脂上，將可疑菌落接種到營養(yǎng)瓊脂上做進(jìn)一步純化，挑取純菌落進(jìn)行處理制成上清液，吸去上清液點樣到96孔靶上后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

上述6中檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌的方法特點見表1。

表1 6種檢驗方法特點對比

2 討論

GB 8538—2016中關(guān)于銅綠假單胞菌的檢測方法是目前基層食品檢驗檢測機(jī)構(gòu)鑒定銅綠假單胞菌的首選方法，國標(biāo)法操作簡單，對試驗人員要求較低，比較適合硬件條件較差的小型企業(yè)和檢驗機(jī)構(gòu)，但不能實現(xiàn)大批量樣本的快速檢驗；另外，判斷菌落顏色存在個人主觀差異，容易造成誤判，試驗結(jié)果準(zhǔn)確性相對較低，經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果[27]。當(dāng)濾膜上的菌落小于50 CFU時，計數(shù)結(jié)果較為理想；當(dāng)濾膜上的菌落達(dá)到100 CFU時，計數(shù)的準(zhǔn)確性將大大降低；另外在CN瓊脂上培養(yǎng)24～48 h的條件使得無法對該菌進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)[28]。

微生物鑒定系統(tǒng)法與國標(biāo)法相比具有準(zhǔn)確性高（可高達(dá)98%[29]）的優(yōu)勢，目前已在微生物檢驗領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但檢測過程中用于鑒定的菌懸液的純度、濃度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基類型以及傳代次數(shù)等因素會對檢驗結(jié)果有較大的影響，對前期準(zhǔn)備階段人工操作的要求較高，且儀器和耗材昂貴，因此對條件一般的實驗室不太適合，適合中型規(guī)模及以上企業(yè)和基礎(chǔ)條件較好的檢驗機(jī)構(gòu)。利用國標(biāo)法和微生物鑒定系統(tǒng)法鑒定銅綠假單胞菌可能會受到熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌的干擾，有可能造成錯判，而其中的API 20E對該菌的鑒定相對準(zhǔn)確和可靠，但也會出現(xiàn)較高的氧化酶假陽性的情況[30]。

16S rRNA基因序列分析法特異性很強(qiáng)，可以鑒定到種，該方法和LAMP檢測法都是從基因?qū)用嫔蠝y定銅綠假單胞菌，操作簡單、準(zhǔn)確率更高，但這2種方法試劑昂貴，對檢驗人員的分子生物學(xué)水平有一定的要求。16S rRNA基因序列分析法需要通過煩瑣的變溫程序進(jìn)行檢測，而LAMP檢測法只需恒溫反應(yīng)進(jìn)行檢測，被認(rèn)為是一種可行的、經(jīng)濟(jì)有效的分子診斷替代手段，且有實驗證明LAMP法的靈敏度比16S rRNA基因序列分析法提高了約9倍[31]。這兩種方法比較適合用于基礎(chǔ)條件好的檢驗機(jī)構(gòu)和科研單位。

酶底物法是根據(jù)銅綠假單胞菌的特異性酶和特異性底物反應(yīng)，通過計數(shù)定量盤熒光孔陽性數(shù)作為檢測結(jié)果的判斷依據(jù)。酶底物法不需要分離純化單菌落，該技術(shù)在24 h內(nèi)即可得到結(jié)果，無需進(jìn)行驗證試驗，與國標(biāo)法的檢驗結(jié)果無顯著性差異[32]，對實驗室及設(shè)備的要求低，適于應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件，但該方法試驗耗材成本較高。酶底物法最重要的一點是可直接定量，可以作為檢測包裝飲用水中的銅綠假單胞菌含量的替代方法，在國外有些國家已批準(zhǔn)作為檢測銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，比較適合用于生產(chǎn)量較大的大型生產(chǎn)企業(yè)及應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的檢驗單位。

MALDI-TOF MS方法檢測包裝飲用水中的銅綠假單胞菌檢出限低，菌液只需到達(dá)104CFU就可以檢測。該方法鑒定銅綠假單胞菌從純菌落處理到儀器鑒定僅需要0.5 h左右的時間，鑒定一般常見的病原菌準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上[33]。但前期儀器投入成本較大，細(xì)菌因生長環(huán)境差異發(fā)生變異或?qū)е禄虮磉_(dá)發(fā)生改變，會出現(xiàn)不同地區(qū)同種菌株的蛋白質(zhì)指紋圖譜之間存在差異，因此商業(yè)數(shù)據(jù)庫會存在某方面的缺陷，需要不斷更新完善。實驗室可根據(jù)本區(qū)域檢出的銅綠假單胞菌建立補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫，彌補(bǔ)該類缺陷，以得到匹配分值更高的結(jié)果。同時，該方法具有高通量的特點，可滿足檢測更大量樣品是的通量需求，但使用該方法產(chǎn)生的結(jié)果會受到儀器狀態(tài)、樣品處理方法、基質(zhì)以及一些人為因素的直接影響。另外，可以將MALDI-TOF MS方法應(yīng)用到檢測銅綠假單胞菌的細(xì)菌耐藥性及藥敏分析方面[34]，比較適用于科研單位、醫(yī)院及應(yīng)對突發(fā)公共事件的檢驗單位。

3 結(jié)語

上述方法從生化水平、基因序列、蛋白指紋圖譜等不同維度分析鑒定銅綠假單胞菌，均有其優(yōu)勢性和局限性。對于一般實驗室，除了考慮鑒定方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性還需要考慮儀器設(shè)備的使用率和成本以及年均樣品量等。根據(jù)實驗室自身實際情況，銅綠假單胞菌的鑒定可以在采用 GB 8538—2016方法的基礎(chǔ)上結(jié)合全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、16S rRNA基因序列分析法、酶底物法以及MALDI-TOF MS法，相互佐證，提高準(zhǔn)確率，減少誤判。