無頭精子癥患者自然生育一例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

王家雄，唐慧#，許詠樂#，郭宏，李紅，楊慎敏*，向菁菁*

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 1.生殖與遺傳中心；2.司法鑒定中心，蘇州 215002)

精子在男性生育中的重要作用毋庸置疑，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時，精子的受精潛能會受到直接影響。受益于二代測序技術(shù)的發(fā)展，精子結(jié)構(gòu)異常的遺傳病因被不斷揭示。比如，CFAP43和CFAP44的缺陷會導(dǎo)致精子鞭毛結(jié)構(gòu)異常從而降低精子活動力[1]。此外，DPY19L2缺陷會導(dǎo)致頂體裝配異常從而影響精卵結(jié)合[2]。無頭精子癥(acephalic spermatozoa syndrome，ASS)是一類典型的精子結(jié)構(gòu)異常，開始被稱為斷頭精子癥(decapitated sperm defect)[3-4]，表現(xiàn)為精子頭頸連接的缺陷[5]，由于其明顯的精子異常表型，吸引了許多研究者的關(guān)注。以往研究顯示SUN5(Sad1 and UNC84 domain containing 5[MIM：613942]) 缺陷是ASS最常見的遺傳病因[5-6]。除此之外，Zhu等[7]還在一對不育的兄弟中鑒定出另一個致病基因PMFBP1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1[HGNC：17728，GenBank：NM_031293.2])。盡管ASS的病例發(fā)掘越來越多，但自然生育的病例還未見報道。本文報道一例已自然生育的SUN5缺陷病例。

病例資料

先證者和其家屬來自于我院生殖與遺傳中心，患者的外生殖器發(fā)育正常，雙側(cè)睪丸和激素水平正常，觸診未見雙側(cè)精索靜脈異常。該研究得到南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者及其家人簽署知情同意書。

一、診療鑒定過程

1.精液常規(guī)與精子形態(tài)分析：精液常規(guī)分析按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗手冊(第五版)》進(jìn)行，并檢測兩次。精子形態(tài)通過精子涂片、改良巴氏染色液染色，計數(shù)200個精子進(jìn)行分析。形態(tài)缺陷根據(jù)之前的研究分為4類[7]：正常、不正常頭頸連接、斷頭(無頭精子附近可以找到對應(yīng)精子頭部)、無頭，計算每個分類所占百分比。

2.掃描與透射電鏡：收集新鮮的精子樣本400g離心15 min，PBS清洗兩次，2.5% 戊二醛固定。經(jīng)過脫水和滲透后，將樣本品包埋在Epon 812樹脂包埋劑(美國SPI)中，并用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對超薄切片進(jìn)行染色。用透射電鏡(TECNAI-10，Philips，荷蘭)以80 kV的加速電壓觀察并記錄超微結(jié)構(gòu)。用離子噴霧儀(ACE200，Leica，德國)噴射膠體金涂覆樣品，并用掃描電鏡(Nova NanoSEM 450，美國)以5 kV的加速電壓進(jìn)行分析。

3.全外顯子測序、Sanger測序以及數(shù)據(jù)分析：基因組DNA通過QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)提取。使用至少3 μg患者DNA通過xGenExome research panel v1.0(Integrated DNA Technologies，美國)創(chuàng)建富集的DNA庫。經(jīng)過生物信息學(xué)分析后，過濾并分析數(shù)據(jù)。考慮到表型和遺傳模式，發(fā)現(xiàn)SUN5的一個復(fù)合雜合突變。然后，直接進(jìn)行Sanger測序以驗證推定的突變。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用引物擴(kuò)增SUN5 exon11和exon13的序列。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，隨后通過ABI 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行測序。引物序列見表1。

表1 Sanger測序引物序列

4.親子鑒定：使用AGCU EX20 STR試劑盒v1.0(無錫中德美聯(lián)生物)擴(kuò)增患者及其女兒1 ng的DNA，其中包括牙釉基因和19個常染色體位點(即CSF1PO、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、，D7S820、，D8S1179、FGA、PentaD、PentaE、TH01、TPOX、vWA)。操作嚴(yán)格按照試劑盒中說明書進(jìn)行。PCR后，在ABI 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)上通過毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增的產(chǎn)物，并使用Genemapper ID 3.2軟件(Applied Biosystems，美國)分析數(shù)據(jù)。

二、鑒定結(jié)果

1.SUN5缺陷患者精液檢查結(jié)果及精子形態(tài)學(xué)表型：患者的精子活動力低下，兩次檢測均未發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)精子，異常頭頸連接、斷頭、無頭精子百分?jǐn)?shù)值較高(表2)。光鏡下，與正常對照精子(圖1A)不同，患者的精子頭頸部交界處異常脆弱，導(dǎo)致許多精子只有孤立的頭或尾，呈現(xiàn)明顯的ASS表型，值得注意的是，雖然許多頸部存在異常，但仍然有完整的精子(圖1B)。掃描電鏡圖像顯示了斷裂的連接點(圖1D)，精子頭中段仍然處于連接狀態(tài)，卻出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，如嚴(yán)重的成角彎曲(圖1E、F)，但精子的頭部形狀比較正常。在透射電鏡下，與正常精子(圖1G)不同的是，盡管近端中心體、節(jié)柱、線粒體和所有其他成分在尾部有序排列，ASS患者仍然缺乏完整的植入窩和基底板(圖1H)。

2.測序結(jié)果：測序深度和覆蓋范圍符合后續(xù)分析的條件，結(jié)合患者精子的頭頸連接缺陷，本研究發(fā)現(xiàn)SUN5中的兩個突變(c.781G>A[p.Val261Met]和c.1043A>T[p.Asn348Ile])，分別是Zhu等[5]在2016年和Shang等[8]在2018年以純合突變形式報道過的。Sanger測序結(jié)果證實了該患者的兩個變異，而患者女兒的c.1043A>T表明該患者為復(fù)合雜合子狀態(tài)(圖2)。

3.親子鑒定結(jié)果：患者的妻子經(jīng)過8年備孕后自然受孕，并生育了一個女兒。親子鑒定結(jié)果顯示，父親和孩子的19個常染色體STR基因型，除vWA外，所有位點均符合孟德爾遺傳法，證明了他們之間的生物學(xué)親子關(guān)系(表3)。

表2 患者的精液質(zhì)量參數(shù)

A：光鏡下正常精子形態(tài)(大框示小框區(qū)放大圖)；B：光鏡下ASS患者精子形態(tài)(大框示小框區(qū)放大圖)；C：正常精子掃描電鏡圖；D～F：ASS患者精子掃描電鏡圖；G：正常精子透射電鏡圖；H：ASS患者精子透射電鏡圖；箭頭所示為頭頸連接處。圖1 SUN5缺陷患者精子的形態(tài)學(xué)檢查圖像

箭頭示突變位點。圖2 患者及其女兒的Sanger測序分析結(jié)果

表3 患者和女兒的親子鑒定染色體匹配結(jié)果

討 論

ASS患者的精子存在結(jié)構(gòu)異常，而SUN5是主要致病基因。多胺調(diào)節(jié)因子1結(jié)合蛋白1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1，PMFBP1[GenBank：NM_031293.2])[7]、睪丸特異蛋白10(testis specific 10，TSGA10[MIM：607166])[9]、溴區(qū)結(jié)構(gòu)域睪丸相關(guān)蛋白(bromodomain testis associated，BRDT[MIM：602144])[10]以及中心體蛋白112(centrosomal protein 112，CEP112[MIM：])[11]被鑒定與ASS有關(guān)，但后兩個基因沒有在其他人類患者中被檢測到或沒有被動物模型驗證。除此之外，在小鼠模型中有許多基因也被報道與ASS有關(guān)，如OAZ3[12]、CNTROB[13]、SPATA6[14]等等，但是這些突變都沒有在人類身上發(fā)現(xiàn)過。

SUN5也被稱為精子相關(guān)抗原4樣蛋白(sperm-associated antigen 4-like protein，SPAG4 L)，其編碼基因位于染色體20q11.21中，包含15個外顯子[15]。在精子細(xì)胞中，SUN5蛋白定位于精子核被膜的內(nèi)膜上[6]。如果SUN5存在缺陷，頭頸偶聯(lián)裝置雖然可以很好地組裝，但是它不能連接到核被膜上，就好像吸盤本身沒有組裝問題，但無法吸附到目標(biāo)上。SUN5蛋白包含兩種重要的結(jié)構(gòu)域，分別是其N端的跨膜結(jié)構(gòu)域和C端的保守SUN結(jié)構(gòu)域[16]。本研究中的兩個突變均位于SUN5蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域，這是與偶聯(lián)裝置蛋白DnaJ熱激蛋白家族(Hsp40)成員B13(DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member B13，DNAJB13)相互作用的關(guān)鍵功能域。DNAJB13是精子中與軸絲相關(guān)的成分，在精子發(fā)生過程中位于精子頭尾偶聯(lián)裝置中，SUN5的C末端結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化可能會破壞SUN5蛋白與DNAJB13之間的相互作用，從而導(dǎo)致ASS[8]。

之前所有的研究均認(rèn)為ASS是一種嚴(yán)重的原發(fā)不育，因為ASS患者沒有自然生育的報道，而卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)被認(rèn)為是幫助其成功孕育的唯一手段[17]。迄今為止，有4篇研究報道描述了SUN5突變導(dǎo)致的原發(fā)不育[5-6，8，17]，但只有一篇研究記錄顯示ICSI后的成功妊娠[17]。在本研究中，患者經(jīng)過8年的嘗試，自然生育一個健康的女兒，這是攜帶SUN5致病突變的ASS患者首次自然生育的報道。因此我們認(rèn)為之前報道顯示ASS患者ICSI結(jié)局良好，是由于SUN5缺陷僅僅只是破壞了精子頭尾之間耦合裝置的發(fā)生，對精子的頂體發(fā)生和核內(nèi)遺傳完整性沒有影響[6]。本研究報道表明，盡管ASS患者自然生育存在很大困難，但并非沒有可能，這也預(yù)示著患有此類缺陷的ASS患者的輔助生殖妊娠結(jié)局和后代健康狀況應(yīng)相當(dāng)樂觀。

綜上所述，本中心接收到一例咨詢二胎生育的ASS患者，患者精子表現(xiàn)出典型的ASS表型，即頭頸連接異常，但值得注意的是部分精子頭頸并沒有完全斷開；通過全外顯子測序鑒定，發(fā)現(xiàn)患者是SUN5復(fù)合雜合突變(c.781G>A[p.Val261Met]和c.1043A>T[p.Asn348Ile])。患者第一胎的女兒為患者親生并攜帶c.1043A>T雜合突變，表明該患者為SUN5的復(fù)合雜合突變對蛋白質(zhì)的影響小于純合突變，提示雖然SUN5缺陷將導(dǎo)致ASS，但對于輕度患者仍然有自然生育的機(jī)會。本研究為ASS患者的遺傳咨詢和輔助生殖治療提供了臨床參考，但需要進(jìn)一步的分子功能機(jī)制研究來解釋由不同的SUN5突變類型引起的不同表型。