臨床常用中藥制劑對OVCAR3細胞的藥效學比較

隗雅姿， 袁慶東， 肖向茜*， 楊怡姝， 李勁濤， 盛 望

(1.北京工業(yè)大學，北京 100124；2.北京市羊坊店醫(yī)院，北京 100038)

卵巢癌是常見的女性生殖器官腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌和宮頸癌，由于腫瘤位于盆腔深部，早期癥狀不典型，因此早期診斷困難，70%患者初診即為中晚期。根據(jù)《2019 NCCN卵巢癌包括輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌臨床實踐指南》[1]，目前除手術治療之外，還是采用以鉑為基礎的聯(lián)合化療方案，常用藥物為順鉑、卡鉑、紫杉醇、多西他賽、多柔比星、貝伐珠單抗等[2-5]。由于上述化療藥物有較強的毒副作用[6]，有時候患者難以耐受，臨床常常應用中藥以減輕化療藥物的毒副作用，增強化療藥物的抗腫瘤活性。但是，某些臨床常用中藥單獨應用在卵巢癌中的效果沒有報道，并且這些中藥在卵巢癌中的抗腫瘤活性強弱的比較也沒有報道。因此，本研究選擇幾種臨床常常用于腫瘤輔助治療且文獻報道在體內外單獨應用時具有直接抗腫瘤活性的中藥制劑，包括參芪扶正注射液[7]、消癌平注射液[8]、復方苦參注射液[9]、艾迪注射液[10]、康艾注射液[11]、康萊特注射液[12]等，或者中藥來源的單體化合物(欖香烯注射液[13])，以順鉑[14]、紫杉醇[15-16]為對照藥物，比較它們對OVCAR3細胞的抗腫瘤作用。

實時無標記細胞分析(RTCA)技術是基于微電子阻抗技術的細胞檢測方法。細胞檢測板的每個細胞生長孔底部鋪有微電子細胞傳感器芯片，可用于檢測細胞貼附與生長，從而方便構建實時、動態(tài)、定量跟蹤細胞增殖分化的細胞阻抗檢測傳感系統(tǒng)。當貼壁生長在微電極表面的細胞引起貼壁電極界面阻抗的改變時，這種改變與細胞的實時功能狀態(tài)改變成相關性，通過實時動態(tài)的電極阻抗檢測可以獲得細胞生理功能相關的生物信息即細胞指數(shù)(cell index, CI)，包括細胞生長、伸展、形態(tài)變化、浸潤及遷移、死亡和貼壁等。由于待測藥物康萊特注射液是乳濁液，影響CCK8實驗中對底物顏色的檢測，因此，本研究主要采用RTCA法對細胞進行增殖、遷移和侵襲的研究。

1 材料

1.1 細胞 卵巢癌OVCAR3細胞系(上海澤葉生物科技有限公司)；人胚肺成纖維細胞MRC-5細胞系(國家實驗細胞資源共享平臺)。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清(FBS)、RPMI1640細胞培養(yǎng)液、MEM eagle’s細胞培養(yǎng)液、青鏈霉素、非必需氨基酸(NEAA)、PBS緩沖液(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Matrigel?Marix(美國Corning公司)；CCK8試劑盒[東仁化學科技(上海)有限公司]。RTCA活細胞檢測儀、E-Plate 16、CIM-Plate[艾森生物(杭州)有限公司]；高內涵成像分析系統(tǒng)、多功能讀板機(美國PerkinElmer公司)。

1.3 藥物 參芪扶正注射液(國藥準字Z1990065，廣東麗珠集團利民制藥廠，批號170833)；康萊特注射液(國藥準字Z10970091，浙江康萊特藥業(yè)有限公司，批號1709297-1)；復方苦參注射液(國藥準字Z14021231，山西振東制藥股份有限公司，批號20170312)；康艾注射液(國藥準字Z20026868，長白山制藥股份有限公司，批號03181003)；欖香烯注射液(H20110114，石家莊制藥集團有限公司，批號18040602)；艾迪注射液(國藥準字Z52020236，貴州益佰制藥股份有限公司，批號20170844)；通關藤注射液(消癌平注射液)(國藥準字Z20025868，南京圣和藥業(yè)股份有限公司，批號201812071)；紫杉醇注射液(國藥準字H20084439，華北制藥股份有限公司，批號FPW1710001)；注射用順鉑(凍干型)(國藥準字H20023461，齊魯制藥有限公司，批號FA4A7008A)。

2 方法

2.1 中藥制劑對OVCAR3細胞增殖的影響 取E-Plate 16孔板，每孔內加入50 μL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，放入RTCA實時細胞檢測儀檢測基線。將對數(shù)生長期的OVCAR3細胞消化并吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為5×104/mL，加入E-Plate 16孔板中，每孔100 μL，室溫靜置30 min使細胞沉降，放入實時細胞檢測儀過夜貼壁。將藥物進行連續(xù)稀釋，每種制備5個劑量，每個劑量3個復孔，每孔50 μL，分別為欖香烯注射液10、20、40、60、80 μg/mL，參芪扶正注射液5、10、20、30、40 mg/mL，復消癌平注射液50、100、200、300、400 mg/mL，復方苦參注射液50、100、200、300、400 mg/mL，艾迪注射液15、30、45、60、75 mg/mL，康艾注射液20、40、60、80、100 mg/mL，康萊特注射液5、10、15、20、25 mg/mL，注射用順鉑(凍干型)5、10、20、40、80 μmol/L，紫杉醇注射液0.39、1.56、6.25、25、100 nmol/L，對照組加入等體積細胞培養(yǎng)液。加藥后，立刻將E-Plate板放回檢測儀中，檢測72 h內細胞增殖曲線。上述實驗重復2次。

2.2 中藥制劑對OVCAR3細胞遷移的影響 在CIM Plate-16下室加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液165 μL，作為實驗組和陽性對照組；加入等體積不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)液，作為空白對照組。安裝上室并加入30 μL無血清培養(yǎng)液，將CIM Plate-16置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中平衡1 h，放入儀器檢測基線。

取對數(shù)生長期細胞，制備單細胞懸液，根據(jù)預實驗結果，以無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為4×105/mL。從RTCA儀器上取下CIM-Plate16孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，實驗組每孔加入以無血清細胞培養(yǎng)液配制不同的藥物，每種藥物3個劑量，每個劑量3個復孔，每孔50 μL，分別為欖香烯注射液20、40、80 μg/mL，參芪扶正注射液10、20、40 mg/mL，消癌平注射液100、200、400 mg/mL，復方苦參注射液100、200、400 mg/mL，艾迪注射液30、45、60 mg/mL，康艾注射液60、80、100 mg/mL，康萊特注射液15、20、25 mg/mL，注射用順鉑(凍干型)5、10、20 μmol/L，紫杉醇注射液1.56、3.125、6.25 nmol/L，陽性對照組、空白對照組加入等體積無血清細胞培養(yǎng)液，將CIM Plate-16孔板放入RTCA儀器，檢測24 h內細胞遷移情況。上述實驗重復2次。

2.3 中藥制劑對OVCAR3細胞侵襲的影響 根據(jù)預實驗結果，用預冷的無血清RPMI1640培養(yǎng)液按照1∶40比例稀釋Matrigel，最終使加入CIM-Plate 16孔板上室的體積為20 μL/孔，將包被Matrigel的上室放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中4 h，使膠凝固。上室中加入細胞懸液至密度為6×105/mL，儀器工作程序、藥物濃度均與“2.2”項下相同，檢測24 h內細胞侵襲情況。上述實驗重復2次。

2.4 中藥制劑對MRC-5細胞的增殖活性的影響 將MRC-5細胞制成密度為8×104/mL的單細胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL，過夜貼壁。將藥物加入96孔板中(終劑量同“2.1”項)，每個劑量4個復孔，對照組加入細胞培養(yǎng)基，放置于細胞培養(yǎng)箱孵育72 h后加入CCK8試劑，并于細胞培養(yǎng)箱中孵育40 min，放入多功能讀板機中測定450 nm處吸光度。上述實驗重復3次。為了比較藥物對腫瘤細胞和正常細胞的作用，同時對OVCAR3細胞也進行了72 h CCK8檢測。

2.5 中藥制劑對OVCAR3細胞凋亡的影響 根據(jù)細胞增殖實驗結果，將各藥物的穩(wěn)定IC50近似濃度作為凋亡實驗檢測濃度，但有些藥物未能計算出IC50(參芪扶正注射液、康艾注射液、康萊特注射液)，故再將原始藥物稀釋4倍，檢測細胞線粒體膜電位變化。將4×104/mL OVCAR3細胞懸液加到96孔板中，每孔100 μL，過夜貼壁，加入藥物，每種藥物3個復孔，每孔100 μL，對照組加入等量細胞培養(yǎng)液，分別為欖香烯注射液50 μg/mL，艾迪注射液50 mg/mL，復方苦參注射液150 mg/mL，參芪扶正注射液35 mg/mL，消癌平注射液250 mg/mL，康艾注射液100 mg/mL，注射用順鉑(凍干型)10 μmol/L，紫杉醇注射液5 nmol/L。處理24 h后，吸出上清，每孔加入50 μL 1 μmol/L JC-1工作液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS洗滌2次，加入50 μL 4 ℃預冷的成像緩沖溶液，在高內涵成像分析系統(tǒng)中拍照，檢測熒光強度，計算紅/綠熒光的比值(R/G)。另外，康萊特注射液為乳濁液，不易經洗滌去除，會影響在熒光顯微鏡下的觀察相關，故不用于凋亡檢測。上述實驗重復3次。

3 結果

3.1 中藥制劑對OVCAR3細胞增殖活性的影響 藥物對OVCAR3細胞的作用曲線見圖1。

注：參芪扶正注射液、康艾注射液、康萊特注射液在各劑量下均無明顯抑制作用，無法計算IC50，故未繪制曲線。圖1 中藥制劑對OVCAR3細胞增殖的影響(n=2)

本實驗設定每隔15 min儀器掃描各孔細胞狀態(tài)1次，IC50隨時間變化的曲線見圖2。由此可知，欖香烯注射液、消癌平注射液、復方苦參注射液、艾迪注射液在與OVCAR3細胞作用36 h后IC50值基本穩(wěn)定，且一直持續(xù)到72 h，提示今后可縮短上述藥物觀察時間。另外，取36～72 h內所有時間點(共144個)的IC50，計算平均值，較單點實驗能更客觀代表藥物的抗腫瘤作用。

圖2 IC50隨時間變化的曲線(n=2)

3.2 中藥制劑對OVCAR3細胞遷移的影響 RTCA實時細胞檢測儀前2 h每隔2 min掃描OVCAR3細胞遷移狀態(tài)1次，之后每15 min掃描1次，得到細胞指數(shù)。本實驗檢測欖香烯注射液、注射用順鉑(凍干型)處理OVCAR3細胞24 h內實時細胞遷移曲線和STD值，共計150個時間點，見圖3。由此可知，在不同劑量下2種藥物對OVCAR3細胞遷移均有抑制作用。

注：細胞遷移檢測時間一般不超過24 h，以減少細胞增殖對檢測結果的干擾。與陽性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 中藥制劑對OVCAR3遷移的影響(n=2)

3.3 中藥制劑對OVCAR3細胞侵襲的影響 藥物處理OVCAR3細胞10～24 h內的實時細胞侵襲曲線和STD值見圖4。由此可知，除了康萊特注射液、注射用順鉑(凍干型)、紫杉醇注射液外，其他藥物至少在1個劑量下可抑制OVCAR3細胞侵襲。

3.4 中藥制劑對MRC-5、OVCAR3細胞的毒性 表1顯示，紫杉醇注射液IC50(MRC-5)/IC50(OVCAR3)大于5，即對MRC-5細胞的毒性遠低于對OVCAR3細胞的毒性；欖香烯注射液、艾迪注射液、注射用順鉑(凍干型)IC50(MRC-5)/IC50(OVCAR3)約等于1，即對2種細胞的毒性相近；復方苦參注射液、參芪扶正注射液、消癌平注射液IC50(MRC-5)/IC50(OVCAR3)小于1，即對MRC-5細胞的毒性更高。

表1 中藥制劑對MRC-5、OVCAR3細胞的毒性(n=3)

圖5 中藥制劑作用24 h后OVCAR3線粒體膜電位(×20)

3.5 中藥制劑對OVCAR3細胞凋亡的影響 圖5、表2顯示，紫杉醇注射液、注射用順鉑(凍干型)、消癌平注射液、欖香烯注射液可引起線粒體膜電位改變(早期凋亡信號)，出現(xiàn)時間一般在藥物作用10 h后，而其他藥物在24 h內未觀察到上述現(xiàn)象，其原因可能為劑量設定較低，導致需要更長時間才能發(fā)揮作用，也可能是通過其他途徑來促進腫瘤細胞凋亡。

表2 中藥制劑作用24 h后OVCAR3線粒體膜電位

4 討論

中藥用于腫瘤治療已有多年，臨床大多作為化療藥物的輔助治療，本研究檢測的多種中藥以及來源于中藥的單體化合物β-欖香烯在卵巢癌的臨床應用也有較多報道。但是，相比之下哪種藥物對卵巢癌具有直接的抑制作用且效果更好呢？目前尚無相關研究報道。本研究選擇了幾種臨床常用，且文獻有報道用于卵巢癌的中藥以及中藥溫郁金提取物β-欖香烯作為待測藥物，中藥制劑均為市售靜脈輸液劑型。采用實時細胞檢測技術，對給藥后細胞增殖曲線進行檢測，發(fā)現(xiàn)對于卵巢癌來說，欖香烯注射液、消癌平注射液、復方苦參注射液和艾迪注射液均有一定療效。而參芪扶正注射液、康艾注射液和康萊特注射液在較高濃度下有一定作用，但是抑制作用較弱，不能計算出半數(shù)抑制濃度，但是本實驗中也不宜提高藥物濃度，因為市售注射液劑型為滅菌水或生理鹽水配制，在細胞實驗時至少稀釋4倍方可忽略細胞培養(yǎng)液成分差異造成的影響。

在遷移實驗中，設定高、中、低3個濃度，其中中濃度與IC50接近。未測得IC50值的藥物則采用增殖抑制實驗中較高的3個濃度。結果顯示，除了注射用順鉑(凍干型)在IC50附近有抑制遷移的作用之外，只有欖香烯注射液在高濃度時可以抑制遷移，其他藥物在實驗濃度下抑制腫瘤細胞遷移的作用不明顯，甚至康萊特注射液和康艾注射液兩個藥物在本實驗中顯示出腫瘤細胞遷移數(shù)量超過對照組。

在侵襲實驗中，欖香烯和大多數(shù)中藥都顯示出了一定的抑制作用，包括在增殖抑制實驗和遷移實驗中效果不佳的康艾注射液，高濃度時也顯示出了抑制侵襲的作用。不過康萊特注射液和紫杉醇注射液的效果不佳。

本實驗顯示紫杉醇注射液抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的作用弱。Chang等[17]在2017年發(fā)現(xiàn)紫杉醇促進小鼠乳腺癌肺轉移的分子機制，紫杉醇通過Atf3基因使腫瘤周圍的血管密度增加，促進乳腺癌細胞進入血液循環(huán)，同時促進肺組織中的穿孔素(存在于細胞毒性T細胞和NK細胞)表達下調，炎性單核細胞數(shù)量上調，趨化因子配體2表達上調，從而改變了肺組織的微環(huán)境，使腫瘤細胞更利于在肺組織定植。

抗腫瘤化療藥物往往對正常組織細胞也有一定的毒性作用，部分患者因不能耐受藥物的副作用而停止化療。中藥達到抑制腫瘤細胞增殖效果時，其對正常組織細胞的作用鮮見報道。中藥制劑的毒副作用發(fā)生的靶組織和靶細胞不盡相同，本研究只選取了一種人胚肺成纖維細胞系MRC-5代表正常細胞進行實驗，如果需要了解中藥制劑對正常組織器官的毒理學作用，還需要更多的實驗研究。在本實驗中，紫杉醇注射液對MRC-5毒性最低，其次是欖香烯注射液、艾迪注射液和注射用順鉑(凍干型)，對成纖維細胞和卵巢癌細胞的毒性相近，而在增殖抑制實驗中有一定效果的復方苦參注射液和消癌平注射液對成纖維細胞的毒性甚至大于對OVCAR3細胞的毒性。

為了便于比較，腫瘤細胞線粒體膜電位的檢測采用中藥制劑的IC50附近濃度。經過連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)24 h內出現(xiàn)明顯細胞凋亡的藥物有注射用順鉑(凍干型)、紫杉醇注射液、欖香烯注射液和消癌平注射液。

綜上所述，在臨床常用的化療輔助藥物中，欖香烯注射液無論在對OVCAR3細胞的增殖抑制、遷移抑制、侵襲抑制、促進凋亡等方面，還是對正常細胞系MRC-5的毒性方面，都是效果最好的。艾迪注射液雖然對OVCAR3細胞遷移抑制作用不明顯且未檢測到24 h內的線粒體細胞膜電位改變，但是對腫瘤細胞有增殖抑制作用且對成纖維細胞的毒性較小，是僅次于欖香烯注射液的化療輔助藥物。復方苦參注射液和消癌平注射液表現(xiàn)出對成纖維細胞毒性作用強于卵巢癌細胞，提示應用于對化療藥物敏感的患者時需要更加注意來自于中藥制劑的毒副作用。