氧化苦參堿與安倍生坦聯(lián)用對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室重構(gòu)的作用

李本鵬， 徐玉平， 曾珠亮， 戴貴東

(凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)可導(dǎo)致機(jī)體肺循環(huán)功能障礙，引起肺血管阻力增加，誘發(fā)右心室超負(fù)荷、心室肥厚，最終發(fā)生右心衰竭[1-2]。RhoA是一種小分子蛋白質(zhì)，屬于Rho蛋白家族成員。RhoA GTP酶及其下游ROCK與血管平滑肌收縮、應(yīng)力纖維形成、細(xì)胞遷移及血壓調(diào)節(jié)等過(guò)程有關(guān)[3-4]，RhoA/ROCK蛋白的表達(dá)與高血壓引起的心肌肥厚有密切的關(guān)系[5-6]。苦參性苦、寒，氧化苦參堿是主要活性成分，具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等[7-8]，對(duì)心臟有正性肌力、減慢心率、抗心律失常作用[9]，氧化苦參堿具有較好的抗心肌缺血、腦缺血的作用[10-11]。安倍生坦是內(nèi)皮素-1的選擇性抑制劑，對(duì)肝臟的毒性較小，生物安全性較高，近年來(lái)在治療肺動(dòng)脈高壓上取得了良好的療效[12-13]。本研究在以野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓的基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)RhoA/ROCK通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)來(lái)探討氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦對(duì)心肌保護(hù)的可能分子機(jī)制，為該成分進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料

雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2014-028，預(yù)養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。氧化苦參堿(純度99.8%，批號(hào)20091028)購(gòu)自寧夏紫荊花制藥有限公司；野百合堿(純度大于98%，貨號(hào)B101942)、安倍生坦(貨號(hào)EB0911)均購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司。RhoA、ROCK1、ROCK2抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；相應(yīng)二抗及內(nèi)參β-actin均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 分組及建模 參考文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道，60只大鼠隨機(jī)分成6組，分別為正常組、模型組、氧化苦參堿組、安倍生坦組、氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組(25 mg/kg+10 mg/kg)、氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組(50 mg/kg+10 mg/kg)。模型組和各給藥組皮下單次注射60 mg/kg野百合堿，正常組皮下注射等體積生理鹽水，安倍生坦組按10 mg/kg、氧化苦參堿組按25 mg/kg、氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組分別按25 mg/kg+10 mg/kg、50 mg/kg+10 mg/kg灌胃給藥；正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，共28 d。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在23 ℃左右，12 h/12 h光暗交替。

2.2 心臟肥厚指數(shù)檢測(cè) 末次給藥24 h后，烏拉坦腹腔注射給藥麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血后立即處死，開(kāi)胸取心臟，用4 ℃生理鹽水清洗，剝離心臟上的其他結(jié)締組織，濾紙吸干殘余的生理鹽水后精密稱(chēng)定全心質(zhì)量 (HW)；分離右心室 (RV)、左心室和室間隔(LV+S)，計(jì)算全心質(zhì)量/體質(zhì)量 (HW/BW)及右心室質(zhì)量/左心室和室間隔質(zhì)量(RV/LV+S)比值。將右心室靠近心間的部分分離，放入4%多聚甲醛中固定48 h，剩余部分立即放入液氮凍存后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中備用。

2.3 組織學(xué)觀察 將固定好的大鼠心肌組織用流水沖洗，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、4 μm切片、烤片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

2.4 Western blot檢測(cè)右心室心肌組織中蛋白表達(dá) 取適量?jī)龃娴拇笫笮募〗M織，稱(chēng)定質(zhì)量后剪碎，放入研磨器中研磨，每100 mg加入冷裂解緩沖液1 mL，12 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片。取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，加入裂解緩沖液及上樣緩沖液使終質(zhì)量濃度調(diào)至5 μg/mL，煮沸10 min，-20 ℃冰箱保存。取蛋白樣本100 μg，在8.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中電泳(80 V/100 V)分離，濕法轉(zhuǎn)膜，將條帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后分別用一抗 (RhoA，1∶600；ROCK1，1∶4 000；ROCK2，1∶500；β-actin，1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜3次后加入二抗山羊抗兔(1∶5 000) 室溫孵育2 h，PBST洗膜4次后取出硝酸纖維素膜，加入化學(xué)發(fā)光劑顯色，曝光膠片，條帶以目的蛋白與相關(guān)β-actin光密度比表示，結(jié)果采用Image J軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量和心臟肥厚指數(shù)的影響 各實(shí)驗(yàn)組大鼠初始體質(zhì)量均無(wú)明顯變化(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠終末體質(zhì)量降低(P<0.05)；與模型組比較，氧化苦參堿組、安倍生坦組大鼠終末體質(zhì)量無(wú)明顯變化(P>0.05)，氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組大鼠終末體質(zhì)量增加(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠心臟肥厚指數(shù)和右心室肥厚指數(shù)均增加(P<0.05)；與模型組比較，各聯(lián)合用藥組大鼠心臟肥厚指數(shù)和右心室肥厚指數(shù)均降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴(lài)性關(guān)系；與安倍生坦組比較，各聯(lián)合用藥組和氧化苦參堿大鼠終末體質(zhì)量、右心室肥厚指數(shù)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，各聯(lián)合用藥組大鼠心臟肥厚指數(shù)降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、右心室肥厚指數(shù)、心臟肥厚指數(shù)比較

3.2 氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室組織形態(tài)的影響 如圖1所示，正常組大鼠右心室心肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密；模型組大鼠右心室心肌細(xì)胞間隔變大，排列順序紊亂、胞漿有腫脹,有些區(qū)域心肌纖維化增生；安倍生坦組及氧化苦參堿組大鼠心肌形態(tài)與模型組比較無(wú)明顯變化；各聯(lián)合給藥組大鼠心肌纖維排列間隔較模型組減小，胞漿腫脹也有不同程度的改善。

3.3 氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室心肌組織RhoA蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織內(nèi)RhoA蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，安倍生坦組及氧化苦參堿組大鼠心肌組織內(nèi)RhoA蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組大鼠心肌組織內(nèi)RhoA蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與安倍生坦組比較，氧化苦參堿組大鼠心肌內(nèi)RhoA蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，各聯(lián)合用藥組大鼠心肌細(xì)胞RhoA蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

注：A為正常組，B為模型組，C為氧化苦參堿組，D為安倍生坦組，E為氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組(50 mg/kg+10 mg/kg)，F(xiàn)為氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組(25 mg/kg+10 mg/kg)。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與安倍生坦組比較，△P<0.05。圖2 各組大鼠右心室心肌組織中RhoA蛋白表達(dá)

3.4 氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織內(nèi)ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，氧化苦參堿組大鼠心肌組織內(nèi)ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，安倍生坦組及氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組大鼠心肌組織內(nèi)ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與安倍生坦組比較，各聯(lián)合用藥組心肌細(xì)胞內(nèi)ROCK1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皮下注射野百合堿可引起右心室肥厚，間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞間隙增大；氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦用藥可減輕由野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室病理?yè)p傷，尤其是高劑量的氧化苦參堿與安倍生坦聯(lián)合用藥組最為明顯。病理檢查顯示，氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦用藥對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室心肌損傷具有協(xié)同保護(hù)作用。

RhoA是一類(lèi)具有GTP酶活性的小分子，分子量為24 kDa，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖和凋亡上發(fā)揮著重要作用。作為RhoA的下游靶點(diǎn)，RhoA的主要效應(yīng)底物Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases, ROCKs)介導(dǎo)RhoA誘導(dǎo)的張力纖維和細(xì)胞黏附的形成[14]，在心血管疾病中扮演重要角色，例如肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)脈粥樣硬化和腦血管疾病也是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重要調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)血管張力和重構(gòu)、細(xì)胞增殖、炎癥和氧化應(yīng)激[16-17]。

注：A為正常組，B為模型組，C為氧化苦參堿組，D為安倍生坦組，E為氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組(50 mg/kg+10 mg/kg)，F(xiàn)為氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦組(25 mg/kg+10 mg/kg)。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與安倍生坦組比較，△P<0.05。圖3 各組大鼠右心室心肌組織中ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)

ROCK1和 ROCK2是最早發(fā)現(xiàn)的RhoA下游蛋白，具有高度同源性，其氨基酸排列順序具有65%的同源性，激酶結(jié)構(gòu)域同源性可達(dá)92%[18]，兩者組織表達(dá)存在差異，ROCK1主要在免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肺臟、肝臟上表達(dá)，ROCK2 在心肌、血管、腦組織中高度表達(dá)[19]。ROCK1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，常通過(guò)caspase-3介導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，下調(diào)ROCK1可降低心肌細(xì)胞凋亡[20]，并可上調(diào)TGF-β1表達(dá)，調(diào)控心肌纖維化[21]。研究表明，高血壓、急性心肌梗死時(shí)，ROCK2表達(dá)會(huì)上調(diào)[22],并通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡[21]。因此，RhoA/ROCK可能是預(yù)防或改善心肌肥厚和纖維化的潛在靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明野百合堿所致肺動(dòng)脈高壓大鼠的心肌RhoA/ROCK通路被激活；氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦(25 mg/kg +10 mg/kg、50 mg/kg +10 mg/kg)可抑制野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌細(xì)胞中RhoA的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)ROCK1和 ROCK2的表達(dá)，而且對(duì)ROCK2的影響要大于ROCK1，說(shuō)明氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦用藥后可調(diào)控RhoA/ROCK通路上關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而對(duì)肺動(dòng)脈高壓引起的心肌肥厚有抑制作用。

綜上所述，氧化苦參堿聯(lián)合安倍生坦通過(guò)下調(diào)RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)，減輕心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的病理學(xué)異常改變，維護(hù)心肌結(jié)構(gòu)的完整性，對(duì)野百合堿所致肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室肥厚具有抑制作用。