HPLC-UV-ELSD法同時測定防風(fēng)通圣丸中8種成分

趙 迪， 劉學(xué)芳， 董浩然， 馮素香， 李璐?；?/p>

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046)

防風(fēng)通圣丸由防風(fēng)、川芎、當(dāng)歸等17味藥材組成，可疏風(fēng)清熱、解表通里，對表里俱實(shí)、風(fēng)熱壅盛之癥療效顯著。方中麻黃、防風(fēng)、薄荷、荊芥可祛除外感風(fēng)邪，石膏、黃芩、連翹、梔子可清除熱邪，桔梗、滑石、大黃、芒硝通過祛痰、利尿促便等方法清除內(nèi)邪，川芎、當(dāng)歸、白芍功效活血祛瘀、補(bǔ)血養(yǎng)陰，配以白術(shù)、甘草補(bǔ)氣扶正[1-2]，不僅可作為春季防疫藥物服用，而且對高血壓、過敏性皮膚病、中風(fēng)、部分炎癥性疾病均有治療作用[3-6]。

防風(fēng)通圣丸組方藥味多，化學(xué)成分復(fù)雜，全面穩(wěn)定的質(zhì)量控制方法是對其品質(zhì)的重要保證，2020年版《中國藥典》收載了方中黃芩主要成分黃芩苷的含量測定方法，而近年來相關(guān)文獻(xiàn)大多側(cè)重連翹、黃芩、大黃蒽醌等祛邪藥味的質(zhì)量控制，尚未涉及祛痰藥桔梗、活血補(bǔ)氣藥川芎等[7-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時測定防風(fēng)通圣丸中川芎、防風(fēng)、桔梗、甘草、梔子、黃芩主要成分川芎嗪、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、桔梗皂苷D、甘草苷、梔子苷、黃芩苷、黃芩素的含量，以期為完善該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀系統(tǒng)、2000ES蒸發(fā)光散射檢測器(美國Thermo Fisher公司)；XS105型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑與藥物 梔子苷(批號MUST16020401，純度≥98%)對照品購于成都曼思特生物科技有限公司；川芎嗪(批號CHB180528，純度≥98%)、甘草苷(批號CHB180608，純度≥98%)、升麻素苷(批號CHB190103，純度≥98%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號CHB180318，純度≥98%)、黃芩苷(批號CHB190115，純度≥98%)、桔梗皂苷D(批號CHB190123，純度≥98%)、黃芩素(批號CHB190116，純度≥98%)對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。防風(fēng)通圣丸購于太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司(6 g/袋，批號1809009、1904007、2003005)。乙腈(批號163602)、甲醇(批號16086029)購于美國Tedia公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%醋酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，95%～80%B；20～40 min，80%～70%B；40～55 min，70%～60%B；55～65 min，60%～95%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長260 nm；ELSD漂移管溫度90 ℃；霧化氣體積流量2.5 mL/min；霧化溫度36 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取川芎嗪、梔子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、桔梗皂苷D、黃芩素對照品適量，甲醇稀釋定容，精密吸取適量至量瓶中，甲醇稀釋定容，即得(各成分質(zhì)量濃度分別為川芎嗪95.62 μg/mL、梔子苷95.38 μg/mL、升麻素苷26.81 μg/mL、甘草苷183.8 μg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷24.38 μg/mL、黃芩苷285.0 μg/mL、桔梗皂苷D 522.0 μg/mL、黃芩素29.38 μg/mL)，密封冷藏。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)混勻，精密稱取粉末1 g至錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，密塞搖勻并浸泡20 min，稱定質(zhì)量，超聲(200 W、40 kHz)提取30 min，搖勻，冷卻，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，4 000 r/min離心，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照本品處方，分別制得缺防風(fēng)、缺梔子、缺川芎、缺桔梗、缺黃芩、缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰均達(dá)到基線分離(分離度大于1.5)，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，甲醇稀釋定容至不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以桔梗皂苷D質(zhì)量濃度對數(shù)值或其他7種成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，桔梗皂苷D峰面積對數(shù)值或其他7種成分峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品適量(批號1809009)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得川芎嗪、梔子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、桔梗皂苷D、黃芩素峰面積RSD分別為1.91%、0.97%、1.33%、2.69%、1.38%、2.01%、1.56%、2.47%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得川芎嗪、梔子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、桔梗皂苷D、黃芩素峰面積RSD分別為0.83%、1.98%、0.76%、0.97%、1.21%、1.64%、1.29%、0.87%，表明儀器精密度良好。

1.川芎嗪 2.梔子苷 3.升麻素苷 4.甘草苷 5.5-O-甲基維斯阿米醇苷 6.黃芩苷 7.桔梗皂苷 8.黃芩素1.ligustrazine 2.gardenoside 3.prim-O-glucosylcimifugin 4.glycyrrhizin 5.5-O-methylvisamitol side 6. baicalin7.platycodin D 8.baicalein圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品適量(批號1809009)，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得川芎嗪、梔子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、桔梗皂苷D、黃芩素峰面積RSD分別為1.24%、0.88%、0.79%、1.12%、1.63%、0.97%、1.08%、1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品適量(批號1809009)，研細(xì)混勻，精密稱取0.50 g粉末至錐形瓶中，共6份，精密加入對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，川芎嗪、梔子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、桔梗皂苷D、黃芩素平均加樣回收率分別為99.60%、99.49%、99.80%、99.48%、100.07%、99.35%、99.44%、99.58%，RSD分別為0.52%、1.12%、0.97%、1.10%、1.14%、0.77%、1.23%、1.31%。

2.9 樣品含量測定 取本品3批，每批3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。2020年版《中國藥典》規(guī)定，每1 g防風(fēng)通圣丸含黃芩以黃芩苷計不得低于6.1 mg，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3批樣品中黃芩苷含量均高于6.1 mg，符合相關(guān)要求。

3 討論

藥理研究表明，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷這2種色原酮是防風(fēng)發(fā)揮祛風(fēng)解熱作用的主要活性成分，川芎嗪是評價川芎生物堿含量高低的重要指標(biāo)，2020年版《中國藥典》分別將桔梗皂苷D、黃芩苷、梔子苷、甘草苷作為桔梗、黃芩、梔子、甘草質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行控制[10-13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇防風(fēng)通圣丸中上述成分(結(jié)合黃芩另一主要成分黃芩素)作為指標(biāo)進(jìn)行含量測定。

表2 各成分含量測定結(jié)果(n=3)

本實(shí)驗(yàn)在篩選色譜條件時，考察了提取溶劑甲醇、50%甲醇、80%甲醇，發(fā)現(xiàn)80%甲醇提取時回收率高，雜質(zhì)峰較少。再考察了檢測波長，由于各成分紫外吸收波長差異較大，故設(shè)定240、260、280 nm三波長通道，發(fā)現(xiàn)它們在260 nm處信號均較強(qiáng)，可有效分離，同時桔梗皂苷D共軛結(jié)構(gòu)較少，紫外吸收弱，故聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器對其進(jìn)行測定；最后考察了流動相乙腈-水、甲醇-水，發(fā)現(xiàn)前者洗脫時分離效果較好，并通過調(diào)節(jié)pH來改善峰形，最終選擇乙腈-0.1%醋酸進(jìn)行梯度洗脫[14-18]。