UPLC法同時(shí)測(cè)定雙黃升白復(fù)方中11種成分

覃艷虹， 江 旻， 張 彤,2， 許陳思涵， 楊 駿， 丁 越,2*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203；3.上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，上海 200020)

骨髓抑制是多數(shù)化療藥的常見(jiàn)毒性反應(yīng)，常導(dǎo)致化療中斷或并發(fā)感染[1-3]。雙黃升白復(fù)方為龍華醫(yī)院治療化療后髓抑制的經(jīng)驗(yàn)方[4]，可促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖，改善骨髓造血微環(huán)境[5-7]，由黃芪、黃精、女貞子、天花粉、骨碎補(bǔ)、淫羊藿組成, 功效益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎生髓[8-9]。方中黃芪具有多種活性成分，如黃芪甲苷、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等[10]，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷為主要代表[11]；黃精主要成分為黃精多糖，具有調(diào)節(jié)血糖血脂、增強(qiáng)免疫力等功效[12]；女貞子主要的苯乙醇類成分為紅景天苷[13]，并且2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定其含量不得低于0.7%[14]；骨碎補(bǔ)主要成分包括柚皮苷、新北美圣草苷等，其中柚皮苷為2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定檢測(cè)成分[15]，具有抗氧化、清除自由基等藥理作用[16]；天花粉主要成分為多種氨基酸[17]；淫羊藿中總黃酮醇苷具有促進(jìn)造血功能、強(qiáng)化免疫等功效[18]，2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定其含量不得低于1.5%。

目前，對(duì)雙黃升白復(fù)方主要成分含量測(cè)定的報(bào)道較少，僅石秀峰等[19]通過(guò)測(cè)定淫羊藿苷(HPLC法)、黃芪甲苷(紫外法)含量來(lái)比較顆粒2種純化工藝，但以上2種成分需分別檢測(cè)，耗時(shí)較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC法同時(shí)測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素的含量，以期為該制劑全面質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 series超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；BS124S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；XS105DU電子天平[梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司]。

1.2 試劑與藥物 特女貞苷(批號(hào)200006-202001，純度98.7%)、新北美圣草苷(批號(hào)240079-202006，純度98.2%)、朝藿定A(批號(hào)030050-202006，純度99.2%)、朝藿定B(批號(hào)260078-202006，純度98.6%)、朝藿定C(批號(hào)030049-201912，純度98.2%)對(duì)照品均購(gòu)自上海鴻永生物科技有限公司；寶霍苷Ⅰ(批號(hào)R11M8F31212，純度98.3%)、紅景天苷(批號(hào)N26A11X111127，純度98.2%)、淫羊藿苷(批號(hào)Z11D5B1，純度98.6%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)Y27F9H54731，純度99.9%)、柚皮苷(批號(hào)H24N9Z75896，純度98.9%)、芒柄花黃素(批號(hào)H06S9Z69494，純度99.9%)對(duì)照品均購(gòu)自于上海源葉生物科技有限公司。黃芪(批號(hào)200915，產(chǎn)地甘肅)、黃精(批號(hào)200711，產(chǎn)地湖南)、女貞子(批號(hào)200908，產(chǎn)地湖南)、骨碎補(bǔ)(批號(hào)190422，產(chǎn)地廣東)、天花粉(批號(hào)200718，產(chǎn)地河南)、淫羊藿(批號(hào)200928，產(chǎn)地陜西)均由上?？禈蛑兴庯嬈邢薰咎峁?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心丁越研究員鑒定為正品。95%乙醇(分析純，批號(hào)20200812，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純[中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司]。

2 方法和結(jié)果

2.1 提取液制備

2.1.1 醇提液 取6味組方藥材共150 g(生藥量)，加10倍量55%乙醇回流提取3次，每次1 h，回收乙醇，濃縮至1∶1，即得。

2.1.2 水提液 按照處方，取生黃芪、黃精等6味藥材共150 g(生藥量)，10倍量水煎煮3次，合并水提液，過(guò)濾后濃縮至1∶1，即得。

2.1.3 水提醇沉液 量取50 mL水煎提取濃縮液，加無(wú)水乙醇調(diào)至醇體積分?jǐn)?shù)為80%，密封，冷藏24 h后取出，濾過(guò)，濾液濃縮，80%乙醇定容至50 mL量瓶中，即得。

2.1.4 陰性樣品 按照處方，分別制得缺黃芪、缺骨碎補(bǔ)、缺女貞子、缺淫羊藿的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 供試品溶液制備 精密吸取濃縮液1 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇混勻、定容，進(jìn)樣前用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.086 mg/mL、朝藿定A 0.095 mg/mL、朝藿定B 0.480 mg/mL、朝藿定C 0.204 mg/mL、淫羊藿苷0.756 mg/mL、寶霍苷Ⅰ 0.044 mg/mL、紅景天苷0.943 mg/mL、新北美圣草苷0.535 mg/mL、柚皮苷1.122 mg/mL、特女貞苷0.952 mg/mL、芒柄花黃素0.003 5 mg/mL的溶液(已按其純度折算)，即得，室溫避光保存。

2.4 色譜條件 Aglient Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流動(dòng)相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量0.3 mL/min；不設(shè)柱溫；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm(毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ)、280 nm(紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷)、254 nm(特女貞苷、芒柄花黃素)；進(jìn)樣量2 μL。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。由此可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，附近無(wú)其他雜質(zhì)峰干擾，表明該方法專屬性良好。

表1 梯度洗脫程序

1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 2.朝藿定A 3.朝藿定B 4.朝藿定C5.淫羊藿苷 6.寶霍苷Ⅰ 1.calycosin-7-glucoside 2.epimedin A 3.epimedin B 4.epimedin C 5. icariin 6.baohuoside I圖1 各成分UPLC色譜圖(270 nm)Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents (270 nm)

7.紅景天苷 8.新北美圣草苷 9.柚皮苷7.salidroside 8.neoeriocitrin 9.naringin圖2 各成分UPLC色譜圖(280 nm)Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents (280 nm)

10.特女貞苷 11.芒柄花黃素10.nuezhenide 11.formononetin圖3 各成分UPLC色譜圖(254 nm)Fig.3 UPLC chromatograms of various constituents (254 nm)

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，50%甲醇稀釋，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，信噪比(S/N)3、10分別為最低檢測(cè)限、最低定量限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取高、中、低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，連續(xù)3 d，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素日內(nèi)精密度RSD分別為0.1%～2.3%、0.1%～3.1%、0.1%～1.1%、0.1%～3.0%、0.1%～1.3%、0.1%～2.8%、0.1%～2.4%、0.2%～2.3%、0.1%～1.6%、0.3%～1.5%、0.2%～6.8%，日間精密度RSD分別為0.3%～1.8%、0.6%～3.5%、0.7%～4.5%、0.7%～3.6%、0.6%～4.1%、3.1%～3.6%、0.4%～3.4%、3.0%～1.2%、0.5%～4.2%、0.9%～4.4%、0.4%～4.2%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取水提濃縮液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素峰面積RSD分別為1.5%、1.0%、1.1%、0.2%、0.3%、0.8%、0.5%、0.6%、0.8%、2.2%、3.0%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取水提濃縮液1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素含量RSD分別為0.4%、0.6%、1.5%、1.4%、1.2%、2.7%、1.0%、0.8%、1.1%、0.5%、4.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取各成分含量已知的水提濃縮液9份，每份0.5 mL，分別加入80%、100%、120%水平對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素平均加樣回收率分別為102.41%、102.99%、104.21%、102.51%、103.85%、102.90%、104.24%、99.25%、102.16%、104.01%、102.57%，RSD分別為1.0%、0.4%、1.4%、1.4%、0.8%、0.8%、0.6%、0.7%、0.5%、0.7%、0.7%。

2.7 樣品含量測(cè)定 取3種提取方法所得濃縮液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，再采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各成分線性關(guān)系

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)篩選 黃芪主要有效成分為黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，前者含量不得低于0.080%，本實(shí)驗(yàn)先選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷。黃精、天花粉有效成分分別為多糖、氨基酸，兩者紫外檢測(cè)前均需進(jìn)行衍生化，而且方法不同，故今后將對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)方法進(jìn)行改進(jìn)；特女貞苷、紅景天苷、寶霍苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、柚皮苷為2020年版《中國(guó)藥典》中女貞子、淫羊藿、骨碎補(bǔ)的質(zhì)量控制指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察以上8種成分。此外，雙黃升白復(fù)方中芒柄花黃素、新北美圣草苷含量較高，故將兩者也納入檢測(cè)指標(biāo)。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)先采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，在200～600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，并結(jié)合 2020年版《中國(guó)藥典》，最終確定為270、280、254 nm。再比較水-甲醇、水-乙腈洗脫時(shí)色譜分離情況，發(fā)現(xiàn)后者分離度更高，峰對(duì)稱度更好，故選擇其作為流動(dòng)相。然后考察了不同體積流量(0.2、0.25、0.3、0.4 mL/min)、柱溫(25、30、35 ℃)對(duì)色譜峰峰形、分離度、基線的影響，發(fā)現(xiàn)不同柱溫均無(wú)明顯影響，最終確定體積流量為0.3 mL/min，不設(shè)柱溫，進(jìn)樣量為2 μL。

3.3 不同提取液中各成分含量比較 朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷是雙黃升白復(fù)方水提液、醇提液主要成分，并且前者中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、新北美圣草苷含量分別為后者中的1.2、1.4、1.2倍，而后者中寶霍苷Ⅰ、特女g貞苷含量分別為前者中的1.5、1.5倍。另外，該方水提醇沉液澄清度明顯提高，但各成分含量均降低。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC法同時(shí)測(cè)定雙黃升白復(fù)方中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素的含量，通過(guò)方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，符合中藥分析要求。今后，將采用UPLC法進(jìn)一步考察雙黃升白復(fù)方新藥生產(chǎn)的制備工藝。