妊娠期合并心臟病病人血清中MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與母嬰結(jié)局關(guān)系

孔令娟，李恩彩，崔廣樹

妊娠合并心臟病是產(chǎn)科危重癥，其會使孕婦脆弱的循環(huán)系統(tǒng)代謝失償，進一步造成母體和胎兒死亡、巨大兒、新生兒窒息、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[1-3]，給家庭帶來嚴(yán)重影響。近年來對不良妊娠結(jié)局研究從遺傳、環(huán)境因素等層面上升到了分子生物學(xué)層面，研究發(fā)現(xiàn)5，10-亞甲基葉酸還原酶（5，10-methylene folate reductase，MTHFR）與葉酸代謝有關(guān)，其基因突變與自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒窒息等、心血管疾病等不良妊娠結(jié)局有關(guān)[4]。Al-Achkar等[5]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的C677T多態(tài)性是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素，具有C677T突變型TT型孕婦流產(chǎn)風(fēng)險高。Dekker等[6]研究顯示母體受孕期間過度服用葉酸對兒童肺功能產(chǎn)生不利影響，可能與MTHFR基因位點C677T突變有關(guān)。然而，有關(guān)妊娠期合并心臟病病人血清中MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與母嬰結(jié)局關(guān)系研究鮮有報道，因此本研究探討妊娠期合并心臟病病人血清中MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與母嬰結(jié)局關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年2月至2019年10月德州市婦女兒童醫(yī)院妊娠合并心臟病病人88例為妊娠期心臟病組，年齡范圍為22～38歲，年齡（28.52±2.35）歲；另同期選取與妊娠合并心臟病組相近年齡段的92例健康孕婦為對照組，年齡范圍為23～36歲，年齡（29.06±2.87）歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。所有入選對象均為單胎妊娠，均按時進行常規(guī)產(chǎn)前檢查至分娩，并由專人隨訪記錄相應(yīng)妊娠結(jié)局。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會產(chǎn)科學(xué)組編撰的《妊娠合并心臟病的診治專家共識（2016）》[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合NYHA心功能分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級者；（2）臨床資料完整者；（3）漢族人。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有其它嚴(yán)重并發(fā)癥者；（2）中途退出者；（3）依從性差者；（4）嚴(yán)重肝、腎等臟器功能不全者。所有研究對象及近親屬均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑與儀器全血基因組DNA快速抽提試劑盒（貨號NG-8647）購自美國OMEGA公司，Taq DNA聚合酶（貨號68N25）、dNTP（貨號NQ2056）、100bp DNA ladder（貨號SM0321）、限制性內(nèi)切酶Hnif Ⅰ（貨號SM8937）均購自賽默飛世爾生物科技有限公司，C677T多態(tài)性位點PCR引物（貨號NM-2130）由上海英駿生物工程公司合成并提供；PCR分析儀（型號ABI7500）購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取及擴增 孕婦待產(chǎn)前，收集兩組所有研究對象空腹靜脈血2 mL于抗凝管中置-80℃冰箱保存待用。后經(jīng)常規(guī)解凍后采用全血基因組DNA快速抽提試劑盒提取外周血基因組DNA，嚴(yán)格按照操作說明書進行。PCR擴增反應(yīng)體系：滅菌雙蒸水14.2 μL，10×PCR緩沖液2 μL，dNTP 1.6 μL，正向引物與反向引物各 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火45 s、72℃延伸45 s，以上三個步驟循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取出離心備用，對產(chǎn)物進行純化。采用限制性內(nèi)切酶Hnif Ⅰ酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系：10×Buffer 1.5 μL，0.1×BSA 1.5 μL，Hnif Ⅰ 0.8 μL，PCR產(chǎn)物DNA 6 μL，ddH2O 5.2 μL。單管反應(yīng)體積15 μL。反應(yīng)條件：37℃下溫浴2 h，10× Buffer 1.5 μL終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，采用凝膠成像系統(tǒng)分析單核苷酸多態(tài)性基因型結(jié)果。C677T多態(tài)性位點引物序列見表1。

表1 基因多態(tài)性位點引物設(shè)計

1.3.2 觀察指標(biāo) 記錄并比較兩組孕產(chǎn)婦不良母嬰結(jié)局：巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產(chǎn)兒事件發(fā)生率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計數(shù)資料以例（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗；采用Hardy-Weinbery平衡檢測平衡程度。所有數(shù)據(jù)均以P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因C677T位點基因型多態(tài)性Hnif Ⅰ酶切結(jié)果顯示，C677T位點基因型包括：僅有152 bp片段的為野生型（CC），有98 bp和54 bp片段的為純合子（TT），既有152 bp又有98 bp、54 bp片段的是雜合子（CT），見圖1。

圖1 C677T位點基因型檢測

2.2 Hardy-Weinberg平衡定律檢驗根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，對照組與妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點各基因型的期望值和觀察值進行χ2檢驗，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學(xué)研究具有代表性。見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗兩組MTHFR基因C677T位點各基因型期望值和觀察值結(jié)果/例

2.3 MTHFR基因C677T位點多態(tài)性分析與對照組相比，妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率顯著升高（P<0.05）。見表3。

表3 對照組與妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點多態(tài)性分析/例（%）

2.4 MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與妊娠結(jié)局關(guān)系與野生CC型比較，妊娠期心臟病組孕婦突變型雜合子CT型、純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產(chǎn)兒發(fā)生率均升高；與雜合子CT型比較，純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產(chǎn)兒發(fā)生率升高。見表4。

2.5 妊娠期心臟病病人不良妊娠結(jié)局的影響因素分析以是否發(fā)生不良妊娠結(jié)局為因變量，以MTHFR基因C677T位點野生CC型、雜合子CT型、純合子突變TT型為自變量進行二元logistic回歸分析顯示，與MTHFR基因C677T位點野生CC型比較，雜合子CT型、純合子突變TT型發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險分別為2.033倍、1.753倍。見表5，6。

表5 變量賦值表

表6 妊娠期心臟病病人不良妊娠結(jié)局的危險因素分析

3 討論

妊娠合并心臟病是嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥，如未使用恰當(dāng)?shù)奶幚矸椒赡軙斐蓢?yán)重不良妊娠結(jié)局。王宏麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，心功能分級越高，自然分娩率越低，早產(chǎn)、新生兒窒息、低體重兒等不良結(jié)局發(fā)生率越高。因此為了有效改善不良妊娠結(jié)局，對妊娠合并心臟病病人妊娠結(jié)局相關(guān)影響因素進行深入分析在臨床上意義重大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，MTHFR基因及其基因突變與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系越來越受到關(guān)注。

MTHFR基因位于染色體1p36.3，是葉酸代謝過程中關(guān)鍵酶類。MTHFR首先將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5，10-甲基四氫葉酸，5，10-甲基四氫葉酸使同型半胱氨酸甲基化為蛋氨酸[9-11]。MTHFR基因突變使MTHFR活性降低，使5，10-亞甲基四氫葉酸向5，10-甲基四氫葉酸的轉(zhuǎn)化減弱，進一步導(dǎo)致同型半胱氨酸甲基化為蛋氨酸受阻，從而使同型半胱氨酸堆積，最終引起高同型半胱氨酸血癥[12]。高同型半胱氨酸升高使甲基轉(zhuǎn)移酶受抑制，進一步造成低甲基化，最終使染色體不分離，從而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局（如唇腭裂、新生兒畸形、早產(chǎn)等）發(fā)生[13]。郭從從等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點多態(tài)性可能與先天性心臟病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MTHFR基因C677T位點多態(tài)性有野生型（CC）、純合子型（TT）、雜合子型（TC），且C677T位點多態(tài)性分布頻率服從Hardy-Weinberg平衡定律，提示所選樣本均來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學(xué)研究具有代表性。

研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠孕婦相比，不良妊娠孕婦MTHFR C677T位點C/C型基因頻率、C等位基因頻率明顯降低，C/T、T/T基因型頻率及T等位基因頻率明顯升高，提示MTHFR基因多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率分布顯著高于對照組。與吳素琴等研究結(jié)果一致，也說明MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局有密切關(guān)系。再次研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期心臟病組中MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產(chǎn)兒發(fā)生率均高于野生CC型；純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產(chǎn)兒發(fā)生率均高于雜合子TC型。提示妊娠期心臟病組中攜帶突變T基因突變病人不良妊娠結(jié)局發(fā)生率高于無T突變基因病人。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677 TT型是導(dǎo)致育齡期女性不良妊娠結(jié)局發(fā)生的獨立危險因素[16]。提示MTHFR C677能夠明顯增加不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。最后二元logistic回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險分別是野生CC型的2.033倍、1.753倍。進一步提示MTHFR基因多態(tài)性不僅與妊娠期心臟病相關(guān)，且C677T純合突變與不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切。卜春艷等[17]研究顯示，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型與妊娠孕婦子癇前期發(fā)病風(fēng)險有一定相關(guān)性，在子癇前期高風(fēng)險孕婦中進行MTHFR基因C677T多態(tài)性分析，及時補充葉酸，有助于預(yù)防子癇前期發(fā)生。以此推測臨床上對妊娠期心臟病確診或可疑孕婦結(jié)合MTHFR C677T位點多態(tài)性檢測，且對TT高風(fēng)險及CT中風(fēng)險孕婦補充不同劑量葉酸可能有助于降低不良妊娠發(fā)生率。

綜上所述，MTHFR基因多態(tài)性不僅與妊娠期心臟病相關(guān)，且與妊娠期心臟病不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切。研究也存在一定不足，樣本選擇受制于地區(qū)、例數(shù)、人群，需進一步擴大地區(qū)、擴大樣本進一步證實MTHFR基因突變與妊娠期心臟病病人母嬰結(jié)局的關(guān)系。