間斷寒邪暴露對(duì)ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血脂代謝及單核巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響

耿運(yùn)玲，吳圣賢，何小娟，李 立，樊丹采，石英杰，舒海洋，蘇文全，王子卓，杜雅薇

流行病學(xué)表明，冬季心腦血管疾病頻發(fā)，當(dāng)戶外溫度低于18 ℃，溫度每下降1 ℃，心腦血管疾病的死亡率會(huì)隨之增加[1]。眾所周知，心腦血管疾病主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性代謝疾病，許多學(xué)者已經(jīng)展開對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素的研究，其研究的焦點(diǎn)包括脂質(zhì)代謝紊亂及炎癥相關(guān)病理變化過程。

近年來，已有很多關(guān)于冬季對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化造成心血管事件的研究，有研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)寒邪暴露可以促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白 1(uncoupling protein 1，UCP1)依賴性皮下脂肪組織的脂解，繼而出現(xiàn)血脂異常，加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊增生和不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致心血管事件增加[2]。而其后有研究結(jié)論與之相反[3]，但后者與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的持續(xù)寒邪暴露不能加重動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的結(jié)論[4]一致。自然界的冬季及戶外溫度更傾向于間斷寒邪暴露模型。Wang等[5-6]研究表明，間斷寒邪暴露更有利于新陳代謝，且隨著社會(huì)文明的進(jìn)步，現(xiàn)代社會(huì)的人類很少長(zhǎng)期直接暴露于室外極端環(huán)境中[7]，間斷寒邪暴露模式更貼合于人類生活真實(shí)環(huán)境。臨床研究數(shù)據(jù)顯示，在間斷寒邪暴露的環(huán)境下，人體在不影響體質(zhì)量的情況下，棕色脂肪組織富集，進(jìn)而減脂[8]。而相反，有研究表明，間斷寒邪暴露可以在不影響體質(zhì)量的情況下，促進(jìn)皮下脂肪堆積[9]，并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的增生和不穩(wěn)定性[10]。間斷寒邪暴露對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化病人屬于有益條件或有害條件，目前尚不明確。

因而研究間斷寒邪暴露對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血脂代謝及炎癥的影響，可以進(jìn)一步評(píng)估自然環(huán)境中心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用間斷寒邪暴露處理高脂飲食誘導(dǎo)的載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠，觀察小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量、血脂水平及脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1、M2表型占比及M1/M2比值，為預(yù)防臨床上冬季心腦血管頻發(fā)事件提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10～12周齡的ApoE-/-小鼠36只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(29±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0033。

1.2 主要試劑與儀器 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)粉末(pH 7.3)，貨號(hào)：ZLI-9062，購(gòu)自中杉金橋公司；PE anti-mouse CD206(貨號(hào)141706)、FITC anti-mouse F4/80(貨號(hào)123107)、APC anti-mouse CD11c(貨號(hào)117310)及PE Ctrl(貨號(hào)400508)、FITC Ctrl(貨號(hào)400506)、APC Ctrl(貨號(hào)400912)均購(gòu)于Biolegend公司；戊巴比妥鈉(貨號(hào)：TOP0263，Biotoppd公司)；D-Hank′s平衡鹽溶液(HBSS，編號(hào)：Gibco14175)；膠原酶Ⅰ型(Gibco17100)；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

動(dòng)物飼養(yǎng)恒溫箱(北京福意聯(lián)公司)；精準(zhǔn)天平(上海儀器儀表廠)；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Accuri C6，美國(guó)BD公司)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；顯微鏡(型號(hào)DP72，日本Olympus公司)。

1.3 分組與造模方法 將36只ApoE-/-小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為常溫對(duì)照組和間斷寒邪暴露組，每組18只，均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫保持在22～24 ℃，相對(duì)濕度50%，12 h交替光照。兩組小鼠均采用基礎(chǔ)飼料于常溫適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲食水。3 d后各組小鼠均接受高脂飲食喂養(yǎng)(配方為78.85%基礎(chǔ)飼料+0.15%膽固醇+21%脂肪，經(jīng)60Coγ照射滅菌處理，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司)，共 16 周，其中后 8 周間斷寒邪暴露組小鼠進(jìn)行每天6 h間斷冷刺激。

間斷寒邪暴露組小鼠造模方法參照文獻(xiàn)[6]，小鼠于每日 08：30～09：00進(jìn)行間斷冷刺激，將小鼠置于 4 ℃動(dòng)物飼養(yǎng)恒溫箱，每天連續(xù) 6 h進(jìn)行冷暴露，剩余 18 h置于20～22 ℃環(huán)境，共8周。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在嚴(yán)格規(guī)范的操作下進(jìn)行。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 進(jìn)食量及體質(zhì)量 每周一、周四15：00左右記錄每只小鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量，并觀察小鼠體型的變化。

1.4.2 脂肪組織重量 用戊巴比妥鈉以60 mg/kg注射麻醉小鼠(稱重0.15 g戊巴比妥鈉晶體加入50 mL蒸餾水配成0.3%的戊巴比妥鈉)，每只小鼠0.8～1.0 mL。摘眼球取血后脫脊處死小鼠，取出小鼠肩胛、腹股溝、附睪部位脂肪組織，并分別稱重記錄。

1.4.3 血脂 間斷寒邪暴露處理8周后，采用生化法檢測(cè)小鼠血漿中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.4.4 單核巨噬細(xì)胞M1、M2 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞M1、M2的占比，并計(jì)算M1/M2比值。用F4/80+標(biāo)記單核巨噬細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，CD11c+CD206-標(biāo)記單核巨噬細(xì)胞M1表型，CD11c-CD206+標(biāo)記單核巨噬細(xì)胞M2表型。

流式細(xì)胞術(shù)方案參照文獻(xiàn)[11]。①配制消解液(7.5% BSA 3 mL+HBSS溶液7 mL+0.02 g膠原酶)，稱取0.1 g膠原酶放入干凈燒杯中，加入7.5% BSA溶液15 mL、HBSS溶液35 mL，放入磁力攪拌子，將溫度調(diào)整為36.5 ℃、轉(zhuǎn)速調(diào)整為150 r/min，攪拌1 h后用保鮮膜封口，錫箔紙避光，過夜后用0.22 μm濾膜過濾除菌。②消解脂肪組織：取脂肪組織后放在PBS中洗去血液，剪碎后放入15 mL錐形離心管中，加入脂肪組織體積1∶1的消解液于37 ℃恒溫水浴箱中消解60 min，直到?jīng)]有可見的塊狀物。③分離巨噬細(xì)胞：消解后，將離心管置于冰上，讓脂肪細(xì)胞和脂質(zhì)(浮在頂部)與基質(zhì)血管成分(SVF)分離，在SVF中可以找到巨噬細(xì)胞。用移液管清除脂肪細(xì)胞和脂質(zhì)。其余的水相將進(jìn)一步使用。使用100 μm過濾器過濾的水相SVF細(xì)胞，除去團(tuán)塊。在4 ℃下，以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。清洗兩遍，取出上清液，將SVF顆粒重懸于1%BSA的PBS緩沖液1 mL中進(jìn)行流式細(xì)胞分析。④流式細(xì)胞分析：調(diào)整細(xì)胞至100 μL中含5×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞濃度可通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定。在室溫下1 500 r/min離心5 min，去除上清液，用FITC anti-mouse F4/80抗體(Fc阻斷劑，1∶200)1 h，防止非特異性抗體結(jié)合。在室溫下1 500 r/min離心5 min；分別用PE anti-mouse CD206抗體、APC anti-mouse CD11c抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照對(duì)細(xì)胞進(jìn)行緩沖和染色。避光孵育細(xì)胞20 min，離心后移除抗體，PBS清洗2次，用200 μL含1%BSA的PBS溶液重懸后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布且方差齊，則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠進(jìn)食量及體質(zhì)量比較 間斷寒邪暴露組小鼠進(jìn)食量較常溫對(duì)照組多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖1；兩組小鼠體質(zhì)量均隨著飼養(yǎng)周期不斷增加，詳見圖2；間斷寒邪暴露處理3周內(nèi)，間斷寒邪暴露組體質(zhì)量較常溫對(duì)照組增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，間斷寒邪暴露組小鼠冷處理第16周體質(zhì)量較常溫對(duì)照組降低(P<0.05)，詳見表1。

圖1 兩組小鼠第1周～第16周平均進(jìn)食量變化

圖2 兩組小鼠第1周～第16周平均體質(zhì)量變化

表1 兩組小鼠第1周～第16周體質(zhì)量比較(±s) 單位：g

2.2 兩組小鼠脂肪組織重量比較 兩組小鼠肩胛間區(qū)棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織、附睪白色脂肪組織重量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 兩組小鼠脂肪組織重量比較(±s) 單位：g

2.3 兩組小鼠血脂比較 與常溫對(duì)照組相比，間斷寒邪暴露組小鼠血液中TG降低(P<0.05)，兩組TC、HDL-C、LDL-C比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 兩組小鼠血脂比較(±s) 單位：mmol/L

2.4 兩組小鼠脂肪細(xì)胞中單核巨噬細(xì)胞M1、M2表達(dá)比較 與常溫對(duì)照組相比，間斷寒邪暴露組肩胛間區(qū)棕色脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1型占比降低，M2型占比升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，M1/M2明顯降低(P<0.01)；腹股溝白色脂肪組織及附睪白色脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1表型占比降低，M2型占比升高，M1/M2降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3～圖5及表4～表6。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肩胛間區(qū)棕色脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1、M2表達(dá)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹股溝白色脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1、M2表達(dá)

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)附睪白色脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1、M2表達(dá)

表4 兩組肩胛間區(qū)棕色脂肪組織中巨噬細(xì)胞M1、M2占比及M1/M2比較(±s)

表5 兩組腹股溝白色脂肪組織中巨噬細(xì)胞M1、M2占比及M1/M2比較(±s)

表6 兩組附睪白色脂肪組織中巨噬細(xì)胞M1、M2占比及M1/M2比較(±s)

3 討 論

中醫(yī)關(guān)于寒與寒邪有很多論述，作為“風(fēng)寒暑濕燥火”六氣之一的寒，是為了完成萬(wàn)物的“閉藏”，正如《傷寒雜病論》中云：“冬時(shí)嚴(yán)寒，萬(wàn)類深藏，君子固密，則不傷于寒”。又如徐春甫《古今醫(yī)統(tǒng)大全》中云：“夫春溫夏熱秋涼冬寒者，四時(shí)之正氣也，以成生長(zhǎng)收藏之用”。人類可“動(dòng)作以避寒”，寒冷太過，則生“寒邪”，歸于“六淫”[12]。寒邪致病，不唯冬季，《徐大椿醫(yī)學(xué)全集》：“寒為肅殺之氣……認(rèn)為中寒不拘冬夏，或外中天地之寒，或內(nèi)受飲食之冷，緣元?dú)鈨?nèi)虛，膚腠空豁，寒邪直中三陰之經(jīng)”。本課題組曾提出，寒邪作用于人體生理狀態(tài)下可以出現(xiàn)“寒極生熱、熱氣生清”，病理狀態(tài)下，出現(xiàn)“寒氣生濁”[13]。課題組進(jìn)一步提出“寒生濁氣”[14]的概念，認(rèn)為寒邪影響人體氣機(jī)，可表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)異常，包括血脂代謝紊亂。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的肥胖病人、代謝綜合征及糖尿病病人，常伴有以TG濃度升高為特征的血脂異常。富含TG的脂蛋白顆?？赡軐?dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化事件的殘留風(fēng)險(xiǎn)[15]。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病合并高TG血癥病人，控制TG水平可以降低不良心血管事件發(fā)生率[16-17]，在LDL-C控制達(dá)標(biāo)時(shí)，心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)仍然較高，而TG作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，降低TG水平將可能降低部分心血管疾病殘余風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠在持續(xù)寒邪暴露狀態(tài)下，小鼠血漿中TC、TG、LDL-C明顯下降；ApoE-/-小鼠在持續(xù)寒邪暴露狀態(tài)下，小鼠TG仍明顯下降，而LDL-C和TC明顯升高[4，20]，并且長(zhǎng)期持續(xù)寒邪暴露并不能加重動(dòng)脈粥樣硬化，這并不能解釋冬季心腦血管事件頻發(fā)這一現(xiàn)象。本課題組認(rèn)為自然環(huán)境下的冷暴露為間斷寒邪暴露，這和持續(xù)寒邪暴露有很大的不同。本研究發(fā)現(xiàn)，間斷寒邪暴露處理后，在TC、LDL-C、HDL-C差異不明顯時(shí)，小鼠血漿中TG仍然降低了15.68%。表明間斷寒邪暴露對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化TG可能有較好的影響，其與心血管疾病的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

多項(xiàng)臨床研究證實(shí)炎癥機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中至關(guān)重要[21-22]，其病理生理過程大體包括[23]：內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥；單核細(xì)胞及白細(xì)胞進(jìn)入粥樣硬化區(qū)；趨化因子和趨化蛋白參與炎癥，細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)入內(nèi)膜；單核細(xì)胞變成組織巨噬細(xì)胞，內(nèi)化脂蛋白顆粒，產(chǎn)生泡沫細(xì)胞；泡沫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子、活性氧等介質(zhì)；巨噬細(xì)胞凋亡，形成成熟斑塊的脂質(zhì)或壞死核心；吞噬細(xì)胞放大局部炎癥反應(yīng)；斑塊纖維帽受損破裂，血栓形成進(jìn)入血液?；诖诉^程，炎癥將作為降低心血管疾病的部分殘余風(fēng)險(xiǎn)的另一靶點(diǎn)[24]。抗炎治療可以降低動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。

肥胖與脂肪組織中慢性炎癥密切相關(guān)，而單核巨噬細(xì)胞在脂肪炎癥中尤為重要[20]。小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞表型至少有兩種，一種是促炎的M1表型，一種是抗炎的M2表型。M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)；M2型巨噬細(xì)胞是抗炎巨噬細(xì)胞，其主要表達(dá)參與組織修復(fù)或重塑的CD206、精氨酸酶-1、白細(xì)胞介素-10(IL-10)。F4/80是脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，CD11c[25]是公認(rèn)的脂肪細(xì)胞中巨噬細(xì)胞M1型的標(biāo)記物，CD206為M2型標(biāo)記物，即F4/80+CD11c+CD206-標(biāo)記巨噬細(xì)胞M1型，用F4/80+CD11c-CD206+標(biāo)記巨噬細(xì)胞M2型[26]。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖狀態(tài)下，小鼠脂肪中巨噬細(xì)胞表型由抗炎巨噬細(xì)胞M2型向促炎巨噬細(xì)胞M1型轉(zhuǎn)化[27-28]。研究小鼠體質(zhì)量及脂肪組織中巨噬細(xì)胞表型的變化可以了解小鼠脂肪組織的代謝性炎癥狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，間斷寒邪暴露后小鼠體質(zhì)量降低，肩胛棕色脂肪組織中M1/M2明顯降低，表明間斷寒邪暴露可以減輕肩胛部位脂肪組織的炎癥狀態(tài)，間斷寒邪暴露有減輕高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠皮下脂肪組織炎癥狀態(tài)趨勢(shì)。這一結(jié)果與先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果[29]并不一致，可能與造模的模型及造模方式不同有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，間斷寒邪暴露后小鼠皮下脂肪組織并未堆積，這一結(jié)果與先前間斷寒邪暴露促使小鼠皮下脂肪堆積的研究[9]并不一致，究其原因，可能與間斷寒邪暴露干預(yù)時(shí)間及干預(yù)對(duì)象不同，本研究是從動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功后開始干預(yù)，而動(dòng)脈粥樣硬化模型更適宜研究冬季對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠，在間斷寒邪暴露狀態(tài)下，小鼠體質(zhì)量較常溫對(duì)照組降低，TG降低，肩胛間區(qū)棕色脂肪組織中單核巨噬細(xì)胞M1/M2明顯降低。說明間斷寒邪暴露可以降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠TG，減輕小鼠肩胛部位脂肪組織炎癥狀態(tài)。這一結(jié)論與冬季心腦血管事件頻發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[30]不一致，說明間斷寒邪暴露并不能很好地解釋冬季心腦血管事件頻發(fā)這一問題，仍需進(jìn)一步展開研究。