基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清痰化瘀方治療冠心病痰熱瘀結(jié)證的作用機(jī)制

楊志華，畢穎斐，毛靜遠(yuǎn)，王賢良，李金哲，任曉宇

冠心病是指由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病[1-2]。中醫(yī)學(xué)將冠心病歸屬于“胸痹”“心悸”“水腫”“喘證”等范疇[3]。隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，血瘀、痰濁等冠心病標(biāo)實(shí)證素較前明顯增多，且常郁而化熱，痰熱瘀結(jié)已成為冠心病較常見的中醫(yī)證候表現(xiàn)[4]。清痰化瘀方為天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院毛靜遠(yuǎn)教授臨床治療冠心病痰熱瘀結(jié)證的經(jīng)驗(yàn)方劑，主要由半夏、瓜蔞(皮)、茯苓、陳皮、丹參、黃連、枳殼組成，方中陳皮、半夏、茯苓是二陳湯的核心藥物組成，具有燥濕化痰、理氣和中的功效，黃連、半夏、瓜蔞(皮)是小陷胸湯的藥物組成，具有清熱化痰、寬胸散結(jié)的功效，丹參活血化瘀、通經(jīng)止痛，枳殼理氣寬中，全方共奏清熱化痰、活血化瘀、理氣寬胸的功效。臨床實(shí)踐提示，清痰化瘀方可有效緩解冠心病痰熱瘀結(jié)證病人臨床癥狀，提高運(yùn)動(dòng)耐量和生活質(zhì)量。由于中藥及其復(fù)方具有多成分特點(diǎn)，這種復(fù)雜性使其作用機(jī)制難以明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)整合在一起，分析藥物在此網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點(diǎn)或模塊的相互作用關(guān)系，從而理解藥物和機(jī)體相互作用的科學(xué)[5]，從整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與疾病間的相互作用[6]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)清痰化瘀方治療冠心病的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、生物學(xué)過(guò)程、信號(hào)通路等方面進(jìn)行分析，旨在揭示清痰化瘀方治療冠心病痰熱瘀結(jié)證可能的作用機(jī)制，為其臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 清痰化瘀方化學(xué)成分的篩選 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選清痰化瘀方中陳皮、半夏、茯苓、黃連、丹參、瓜蔞(皮)、枳殼的活性成分。藥物在人體內(nèi)要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄(ADME)過(guò)程才能到達(dá)靶器官發(fā)揮其治療作用，基于口服生物利用度(orlbioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)是篩選藥物的關(guān)鍵參數(shù)，以ADME參數(shù)中的OB≥30%、DL≥0.18[7-8]為限制條件進(jìn)行初步篩選，匯總結(jié)果，去除重復(fù)、刪除沒(méi)有相關(guān)信息的化學(xué)成分，即為清痰化瘀方治療冠心病相關(guān)的化學(xué)成分。

1.2 清痰化瘀方潛在靶點(diǎn)的收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)已篩選的清痰化瘀方中藥的化學(xué)成分，通過(guò)TCMSP平臺(tái)檢索與化學(xué)成分相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換為基因名。將篩選的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以coronary heart disease為關(guān)鍵詞，利用DrugBank、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database，TTD)、DisGeNET、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與冠心病相關(guān)的基因，刪除重復(fù)基因，共收集到1 104個(gè)與冠心病相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將冠心病靶點(diǎn)與清痰化瘀方靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析，篩選出二者共同靶點(diǎn)，將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，為確保數(shù)據(jù)的可靠性，蛋白最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence”(>0.9)，對(duì)蛋白相互作用進(jìn)行篩選，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，分析PPI網(wǎng)絡(luò)并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行渲染。在網(wǎng)絡(luò)中，1個(gè)節(jié)點(diǎn)的度(degree)表示在PPI網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，節(jié)點(diǎn)越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)。設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小和顏色深度反映度的大小，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，說(shuō)明節(jié)點(diǎn)的自由度越大。

1.5 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 采用DAVID(Version 6.8，http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)在線分析數(shù)據(jù)工具對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。以錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)率(FDR)<0.01及P<0.01為篩選條件，取P值最小的前20個(gè)生物學(xué)過(guò)程；以P<0.01為篩選條件，篩選富集最顯著的前20條信號(hào)通路，并將通路上的靶點(diǎn)基因以及涉及的化合物、中藥導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，闡明清痰化瘀方治療冠心病的作用機(jī)制。其中的節(jié)點(diǎn)代表化合物、靶點(diǎn)或疾病，邊代表這些節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系，即某個(gè)化學(xué)成分與靶點(diǎn)或靶點(diǎn)與疾病之間的聯(lián)系。

2 結(jié) 果

2.1 清痰化瘀方的化學(xué)成分 本研究從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選清痰化瘀方的化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選結(jié)果：陳皮5個(gè)、半夏13個(gè)、茯苓15個(gè)、黃連14個(gè)、丹參65個(gè)、瓜蔞(皮)11個(gè)、枳殼5個(gè)，刪除重復(fù)成分4個(gè)，剔除沒(méi)有相關(guān)信息成分23個(gè)，共有101個(gè)化學(xué)成分。部分化學(xué)成分信息詳見表1。

表1 清痰化瘀方部分化學(xué)成分基本信息

(續(xù)表)

2.2 清痰化瘀方“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò) Cytoscape 軟件中 network analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫角逄祷龇健爸兴?化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。圖中共包括361節(jié)點(diǎn)，其中，7個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)，101個(gè)化學(xué)成分節(jié)點(diǎn)，253個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和1 501條邊。紅色三角形代表7味中藥的節(jié)點(diǎn)，綠色矩形代表靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，櫻桃紅、淡紅色、綠色、黃色、藍(lán)色、深藍(lán)色、淺綠色菱形分別代表枳殼、陳皮、茯苓、半夏、丹參、瓜蔞(皮)、黃連的化學(xué)成分節(jié)點(diǎn)，MOL004328和MOL005828是陳皮、枳殼兩味中藥的化學(xué)成分，MOL000358、MOL002776分別是半夏和枳殼、半夏和丹參共有的化學(xué)成分。分子MOL000098(quercetin)有 141個(gè)潛在靶標(biāo)，其次是MOL007154(tanshinone ⅡA)有39個(gè)靶標(biāo)，MOL000358(beta-sitosterol)有37個(gè)靶標(biāo)、MOL000006(luteolin)有 36個(gè)潛在靶標(biāo)，MOL002174(baicalein)有34個(gè)。這些度值較高的藥物分子有可能在清痰化瘀方的藥理功能中發(fā)揮相對(duì)重要的作用。在253個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)中有142個(gè)靶標(biāo)至少與2個(gè)化合物連接，網(wǎng)絡(luò)中絕大多數(shù)候選化合物與 2 個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)連接，也說(shuō)明清痰化瘀方中含有的候選化合物分子可能作用于整個(gè)生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，體現(xiàn)了清痰化瘀方多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制，同時(shí)也符合中藥復(fù)方的特點(diǎn)。

圖1 清痰化瘀方中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1 104個(gè)冠心病靶點(diǎn)與254個(gè)藥物靶點(diǎn)輸入Venny 2.1軟件得到112個(gè)共同靶點(diǎn)。將112個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，去除無(wú)相互作用的靶點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。該網(wǎng)絡(luò)由96個(gè)節(jié)點(diǎn)、300條邊組成，平均節(jié)點(diǎn)長(zhǎng)度為6.25，其中，節(jié)點(diǎn)的大小由自由度決定，自由度越大，節(jié)點(diǎn)越大，節(jié)點(diǎn)顏色越深。詳見圖2。

圖2 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 “中藥-化學(xué)成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用 Cytoscape 軟件構(gòu)建清痰化瘀方中藥-化學(xué)成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，圖中共216個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中7味中藥(紅色節(jié)點(diǎn))，96種化學(xué)成分(藍(lán)色節(jié)點(diǎn))，112個(gè)共同靶點(diǎn)(綠色節(jié)點(diǎn))，1種疾病(黃色節(jié)點(diǎn))。結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、川陳皮素(nobiletin)、巴馬汀(palmatine)、4-甲亞基丹參新酮(4-methylene miltirone)、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮(2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione)、黃連素(berberine)等化學(xué)成分度值排名靠前，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關(guān)鍵化學(xué)成分。

圖3 “中藥-化合成分-共同靶點(diǎn)- 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析包括分子功能(molecular function，MF)、生物過(guò)程(biological process，BP)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)3 個(gè)分支。對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，得到640個(gè)GO功能富集條目，以FDR<0.01及P<0.01為篩選條件，前20個(gè)生物學(xué)過(guò)程見表2。結(jié)果顯示，有13個(gè)條目與生物過(guò)程有關(guān)，主要涉及細(xì)胞老化、低氧反應(yīng)、藥物反應(yīng)、NO生物合成過(guò)程正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、正調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖，正調(diào)控RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子等過(guò)程；有3個(gè)條目與細(xì)胞組成有關(guān)，涉及細(xì)胞內(nèi)外間隙等過(guò)程；有4個(gè)條目與分子功能有關(guān)，涉及酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性等過(guò)程。

表2 GO功能富集分析結(jié)果

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID對(duì)112個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到108條信號(hào)通路，以P<0.01為篩選條件，選取清痰化瘀方治療冠心病相關(guān)的前20條信號(hào)通路，見表3。并通過(guò)ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見圖 4)。其中，X 軸表示富集因子(rich factor，即背景基因集中這個(gè)通路所有基因的數(shù)量)，Y 軸代表通路，氣泡大小代表目標(biāo)基因在這個(gè)通路的基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。

表3 20條信號(hào)通路富集分析結(jié)果

(續(xù)表)

圖4 KEGG 通路富集結(jié)果氣泡圖

3 討 論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出清痰化瘀方中藥的101個(gè)有效成分，同時(shí)通過(guò)構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析了中藥、化合物、作用靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，揭示了清痰化瘀方多成分-多靶點(diǎn)治療機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、丹參酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、巴馬汀、4-甲亞基丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黃連素等化學(xué)成分在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中度值較高，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關(guān)鍵化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護(hù)心肌、抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善微循環(huán)、抗凝血及抗血小板聚集、調(diào)血脂、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等作用[9]，丹參酮ⅡA和木犀草素是丹參的活性成分，丹參酮ⅡA具有保護(hù)心肌細(xì)胞、抗凝血、抗血小板聚集、降低高脂血癥大鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積的作用[10-12]；木犀草素可以減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡損害，其機(jī)制可能與減少促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α 及白介素-6(IL-6)的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[13]。黃連具有抗炎、降血糖、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗心律失常等藥理活性[14]，黃連的活性成分槲皮素可通過(guò)抗炎、抗氧化、降低血清三酰甘油和總膽固醇以及抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[15]。半夏和枳殼活性成分中均含有β-谷甾醇，研究表明β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病和高血壓等作用[16-17]。柚皮素、川陳皮素均是陳皮、枳殼的化學(xué)成分，柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、清除自由基的作用[18-20]，對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)心肌的機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[21]，川陳皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等藥理作用[22]。

GO富集分析結(jié)果顯示，清痰化瘀方治療冠心病主要涉及細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激素分泌、NO合成、物質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程；有酶、蛋白、細(xì)胞因子、受體、轉(zhuǎn)錄因子、激素等多種物質(zhì)參與，提示清痰化瘀方治療冠心病是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)對(duì)112個(gè)靶蛋白進(jìn)行PPI分析發(fā)現(xiàn)，TNF、蛋白激酶1(AKT1)、IL-6、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、MAPK8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A(VEGFA)、原癌基因蛋白(FOS)等靶蛋白度值較大，說(shuō)明這些靶蛋白在此網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關(guān)鍵靶蛋白。例如，TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，并且作為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其表達(dá)水平升高可增加心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[23]，血液中TNF-α、IL-6的含量增高可以增加冠心病或者非致死性心肌梗死病人的死亡率[24]。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，清痰化瘀方治療冠心病的較多靶點(diǎn)被富集在TNF、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、Toll樣受體、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)等信號(hào)通路上。HIF-1信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[25]，當(dāng)機(jī)體缺血缺氧時(shí)，HIF-1不僅可以促進(jìn)糖酵解，加強(qiáng)無(wú)氧代謝途徑，使細(xì)胞在缺氧條件下獲得足夠的能量，維持細(xì)胞生存[26]，而且能夠促進(jìn)炎癥中新血管生成[27]；此外，HIF-1可與缺血、缺氧下高表達(dá)的 P53 結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，而 P53 是缺氧條件下誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡的重要參與因子，加快炎癥細(xì)胞凋亡的發(fā)生[28]；HIF-1 還可誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素(EPO)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等促紅細(xì)胞生成因子的表達(dá)，加快氧的運(yùn)輸，提高氧的利用能力[29]，心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，可以通過(guò)調(diào)控HIF-1信號(hào)通路，促進(jìn)血管新生，增加心肌血供，對(duì)保護(hù)心肌具有重要意義[30]。現(xiàn)有的研究結(jié)果證明，cGMP-PKG信號(hào)通路對(duì)于調(diào)控心血管系統(tǒng)的正常功能起著重要的作用，在調(diào)節(jié)血壓、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和抗再狹窄、抗血管損傷、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的收縮和舒張、抑制心肌細(xì)胞肥大等方面發(fā)揮重要作用[31-32]。PKG通路激活能夠通過(guò)引起血管舒張、抑制內(nèi)皮細(xì)胞通透性以及對(duì)心肌細(xì)胞的負(fù)性肌力作用而保護(hù)心血管系統(tǒng)[33]。PI3K-Akt 信號(hào)通路在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡等影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展[34]。韓軍等[35]發(fā)現(xiàn)金絲桃苷激活可通過(guò)激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，改善心室肌收縮與舒張功能，清除氧自由基，減少心肌酶釋放，減輕炎癥反應(yīng)，上調(diào) Bcl-2 蛋白表達(dá)，下調(diào) Bax 蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)清痰化瘀方治療冠心病的化學(xué)成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、生物過(guò)程及通路進(jìn)行了初步探討。結(jié)果顯示，清痰化瘀方中的槲皮素、丹參酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、巴馬汀、4-甲亞基丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黃連素等有效化學(xué)成分，可能通過(guò)作用于TNF、AKT1、IL-6、MAPK3、MAPK8、VEGFA、FOS等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)PI3K-Akt、cGMP-PKG、TNF、HIF-1、Toll樣受體等多條信號(hào)通路治療冠心病。但本研究?jī)H基于系統(tǒng)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，存在一定的局限性，清痰化瘀方治療冠心病的具體作用機(jī)制仍需要開展實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。