不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎化學(xué)成分對(duì)比分析

魯 云，劉佩儀，徐 杰，鄺 敏，陳巧華，梁志毅，程鈺潔，魏 梅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

中藥配方顆粒是以單味中藥飲片為原料，利用現(xiàn)代化工業(yè)技術(shù)精制而成，僅供臨床調(diào)劑用的純中藥制劑，不僅具有免煎、易攜帶、服用方便等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)保留了傳統(tǒng)湯劑辨證施治、隨證加減、復(fù)方配伍的特色[1-2]。近年來(lái)，關(guān)于中藥配方顆?！皢渭搴嫌谩迸c傳統(tǒng)湯劑“群藥合煎”物質(zhì)基礎(chǔ)的一致性一直是大眾比較關(guān)心的問(wèn)題[3-4]。藥對(duì)源于中醫(yī)臨床實(shí)踐，系指通過(guò)相對(duì)固定的組合形式形成配伍單位而發(fā)揮綜合效應(yīng)的兩味中藥[5]。與經(jīng)典方劑相比，藥對(duì)也符合七情配伍理論，且僅有兩味藥，大大降低了多種藥物復(fù)雜化學(xué)成分的干擾，可以實(shí)現(xiàn)以點(diǎn)帶面的降維研究[6]。通過(guò)對(duì)比藥對(duì)單煎與合煎的化學(xué)指紋圖譜，可較為直觀(guān)的反映二者整體物質(zhì)基礎(chǔ)的差異性。麻黃-桂枝藥對(duì)來(lái)源于《傷寒論》中的麻黃湯，是發(fā)汗解表之峻劑[7]。本研究以不同配伍比例的麻黃-桂枝藥對(duì)為例，進(jìn)行單煎與合煎化學(xué)成分的對(duì)比分析，以期為單味中藥配方顆粒合用與群藥合煎的化學(xué)成分一致性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

H-Class 型UPLC 儀（美國(guó)沃特世公司）；Milli-QDirect 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 股份有限公司）；ME204E 型萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JJ3000B 型百分之一天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)）；B-290 型噴霧干燥機(jī)（瑞士步琪有限公司）；DLSB-5L/20 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；YRE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201508，純度為99.8%）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)：171237-201208，純度為99.9%）、肉桂酸（批號(hào)：z110786-201604，純度為98.8%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（德國(guó)Merck 股份有限公司，色譜級(jí)）；磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜級(jí)）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

10 批麻黃藥材分別購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古吉隆生態(tài)科技有限責(zé)任公司（批號(hào)：2005017）、國(guó)藥集團(tuán)馮了性（佛山）藥材飲片有限公司（批號(hào)：2003031、2003032、2003033）、內(nèi)蒙古泰潤(rùn)藥業(yè)有限公司（批號(hào)：1806023、1808024、1812013）、內(nèi)蒙古億利甘草有限公司（批號(hào)：1906041、1908003）、甘肅藥材有限公司（批號(hào)：1911045）；10 批桂枝藥材分別購(gòu)自廣西南藥藥業(yè)有限公司（批號(hào)：2002019、2001021、2001016、2004054）、肇慶市高要區(qū)綠福農(nóng)業(yè)種植專(zhuān)業(yè)合作社（批號(hào)：2006006、2001007）、廣州市藥材公司中藥飲片廠(chǎng)（批號(hào)：2002001）、四川天雄藥業(yè)有限公司（批號(hào)：2008036、2009011、2009005）。所有藥材均經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品。

1.2 方法

1.2.1 麻黃-桂枝藥對(duì)樣品的制備 精密稱(chēng)取麻黃/桂枝飲片適量，分別加水煎煮兩次，煎液濾過(guò)，減壓濃縮，噴霧干燥，即得麻黃、桂枝單煎樣品。根據(jù)麻黃、桂枝的出膏率（出膏率=濃縮液重量×含固率/飲片量×100%）情況，分別按麻黃、桂枝飲片配伍比例（3 : 2、1 : 1、1 : 2、2 : 1）稱(chēng)取單煎樣品（膏粉量=飲片量×出膏率），混勻，平行3 份，即得麻黃-桂枝藥對(duì)單煎樣品。

按照麻黃、桂枝飲片配伍比例（3 : 2、1 : 1、1 : 2、2 : 1） 精密稱(chēng)取上述同批次麻黃、桂枝飲片適量，平行3 份，分別加水煎煮兩次，煎液濾過(guò)，合并兩次煎液，減壓濃縮，噴霧干燥，即得麻黃-桂枝合煎樣品。

1.2.2 供試品溶液的制備 取麻黃-桂枝藥對(duì)樣品適量，取約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別取鹽酸麻黃堿對(duì)照品、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品、肉桂酸對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為125.149 2、103.096 8、32.999 2 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。另取甲醇溶液作為空白對(duì)照溶液。

1.2.4 色譜條件 Waters ACQUITY HSS T3 （2.1 mm ×150 mm，1.8 μm）色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，以體積濃度為0.1%的磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗 脫（0 ～ 10 min，3% ～ 7%A；10 ～ 17 min，7% ～9%A；17 ～ 35 min，9% ～ 10%A；35 ～ 36 min，10% ～17%A；36 ～ 50 min，17% ～ 24%A；50 ～ 70 min，24% ～ 45%A）；柱溫：35 ℃；流速：0.25 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0 ～ 35 min，波長(zhǎng)為210 nm；35 ～ 70 min，波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以2 號(hào)峰（鹽酸麻黃堿）為參照峰S，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取麻黃-桂枝藥對(duì)樣品6 份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以2號(hào)峰（鹽酸麻黃堿）為參照峰S，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以2 號(hào)峰（鹽酸麻黃堿）為參照峰S，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 值均小于3%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

按重量比為1 ∶1 稱(chēng)取10 批麻黃、桂枝飲片，分別按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備10 份麻黃-桂枝藥對(duì)合煎樣品，編號(hào)S1-S10。分別按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采集S1-S10 號(hào)樣品的指紋圖譜，并導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立對(duì)照指紋圖譜R，見(jiàn)圖1。各樣品與對(duì)照指紋圖譜R 的相似度分別為0.942、0.952、0.962、0.907、0.983、0.980、0.994、0.980、0.993、0.937，相似度均在0.9 以上，滿(mǎn)足指紋圖譜研究的要求。建立的麻黃-桂枝藥對(duì)指紋圖譜共標(biāo)定了11 個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了峰2、峰3、峰9 分別為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、肉桂酸，見(jiàn)圖2。

圖1 10 批麻黃-桂枝（1 : 1）藥對(duì)指紋圖譜疊圖Fig. 1 Fingerprints of 10 batches of Ephedra-Cinnamon（1 : 1）herbal pairs

圖2 麻黃-桂枝藥對(duì)指紋圖譜特征峰指認(rèn)Fig. 2 Identification of the characteristic peaks of the fingerprints of Ephedra-Cinnamon herbal pair

2.3 指紋圖譜測(cè)定與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備不同配伍比例的麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品，按“1.2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采集各樣品的指紋圖譜，見(jiàn)圖3。

圖3 不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of Ephedra-Cinnamon herbal pair with different compatibility ratios for single decoction and mixed decoction

計(jì)算各樣品共有峰的“峰面積/稱(chēng)樣量”值，并采用“1.2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，見(jiàn)表1。

結(jié)果顯示，不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品的指紋圖譜均呈現(xiàn)與對(duì)照指紋圖譜相同的11 個(gè)色譜峰，但單煎與合煎樣品中各色譜峰的“峰面積/稱(chēng)樣量”值存在一定差異。表1 結(jié)果表明：（1）4 組不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品峰1、峰4 的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；峰9、峰10、峰11 的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 （2） 當(dāng)麻黃、桂枝配伍比例為2 : 1、3 : 2、1 : 1 時(shí)，單煎與合煎樣品峰6 的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）當(dāng)麻黃、桂枝配伍比例為1 : 1 時(shí)，單煎與合煎樣品指紋圖譜的差異最大，峰1-峰8 的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（4） 4 組不同配伍比例中，有且僅當(dāng)麻黃、桂枝配伍比例為1 :1 時(shí)，單煎與合煎樣品峰2（鹽酸麻黃堿）和峰3（鹽酸偽麻黃堿）的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著麻黃、桂枝配伍比例的變化，各共有峰“峰面積/稱(chēng)樣量”值的變化規(guī)律見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，隨著麻黃比例的減少，峰1-峰5、峰7-峰8 的“峰面積/稱(chēng)樣量”值均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而峰6、峰9、峰10、峰11 均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。因此，初步判定峰1-峰5、峰7-峰8 是麻黃中的化學(xué)成分，而峰6、峰9 -峰11 為桂枝中的化學(xué)成分。

圖4 不同配伍比例的麻黃-桂枝藥對(duì)樣品各共有峰“峰面積/稱(chēng)樣量”值的變化趨勢(shì)Fig. 4 Variation trend of the “peak area/sample weight”value of the common peaks of Ephedra-Cinnamon herbal pair with different compatibility ratios

表1 不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品各共有峰“峰面積/稱(chēng)樣量”值（±s，n = 3）Tab. 1 The “peak area/sample weight” value of Ephedra-Cinnamon herbal pair with different compatibility ratios for single decoction and mixed decoction（±s，n = 3）

表1 不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品各共有峰“峰面積/稱(chēng)樣量”值（±s，n = 3）Tab. 1 The “peak area/sample weight” value of Ephedra-Cinnamon herbal pair with different compatibility ratios for single decoction and mixed decoction（±s，n = 3）

注：不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎同一共有峰相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

共有峰2 : 13 : 2單煎合煎單煎合煎峰1 717 144 ± 6 520** 577 478 ± 9 977 676 133 ± 10 036** 514 378 ± 18 640峰26 896 282 ± 30 393 6 996 088 ± 151 853 6 516 445 ± 109 619 6 370 868 ± 331 071峰3 2 818 885 ± 169 0102 856 969 ± 80 8572 499 674 ± 80 0392 565 436 ± 71 421峰4 5 398 769 ± 24 803**4 923 536 ± 43 867 5 209 431 ± 58 857** 4 642 524 ± 146 928峰5 936 629 ± 5 8231 004 410 ± 47 855 878 616 ± 23 479 927 962 ± 33 997峰6 913 643 ± 81 091**1 284 781 ± 21 588 1 104 666 ± 64 261** 1 451 712 ± 103 646峰7328 763 ± 658* 340 724 ± 5 189 307 989 ± 2 839 311 760 ± 16 546峰8 532 751 ± 1 824 540 151 ± 6 078 499 401 ± 6 847 515 503 ± 15 539峰9 3 425 182 ± 173 292 3 635 472 ± 139 826 3 829 435 ± 128 1403 970 639 ± 83 046峰10 117 709 ± 11 817 130 685 ± 5 814 143 065 ± 11 406 149 421 ± 14 558峰11 173 646 ± 19 642 213 330 ± 27 248 199 214 ± 21 782 214 420 ± 48 055共有峰1 : 11 : 2單煎合煎單煎合煎峰1 609 213 ± 7 449* 539 189 ± 40 418 459 178 ± 32 728** 285 388 ± 12 645峰2 5 989 150 ± 90 886* 5 719 406 ± 131 3014 377 175 ± 23 217 4 170 521 ± 193 469峰3 2 693 013 ± 38 951** 2 329 743 ± 115 961 1 700 851 ± 138 355 1 648 592 ± 107 876峰4 5 055 384 ± 56 503** 4 026 458 ± 165 816 4 215 969 ± 178 354** 3 480 123 ± 140 486峰5 814 689 ± 9 923* 1 048 006 ± 109 597 554 192 ± 33 932** 907 798 ± 31 022峰6 1 605 183 ± 16 745** 1 921 320 ± 106 860 2 494 135 ± 157 028 2 697 258 ± 160 066峰7 282 821 ± 3 939**251 498 ± 5 893 199 969 ± 13 748**248 252 ± 5 628峰8 458 486 ± 5 866**492 253 ± 3 026 330 015 ± 18 469* 372 426 ± 11 397峰94 654 397 ± 57 254 4 753 083 ± 152 336 6 277 794 ± 202 938 6 327 877 ± 128 982峰10 226 633 ± 5 852 217 102 ± 10 114 342 431 ± 18 711 339 669 ± 23 468峰11 336 739 ± 4 142 290 839 ± 46 726 505 323 ± 18 235 347 402 ± 70 895

3 討論

麻黃-桂枝藥對(duì)為常見(jiàn)辛溫解表藥對(duì)，在麻黃湯（麻黃 : 桂枝 = 3 : 2）、小青龍湯（麻黃 : 桂枝 =1 : 1）、桂枝芍藥知母湯（麻黃 : 桂枝 = 1 : 2）、麻黃桂枝湯（麻黃 : 桂枝 = 2 : 1）中均有應(yīng)用，故本研究以上述4 組麻黃、桂枝比例為例，比較單煎與合煎樣品中化學(xué)成分的差異。結(jié)果表明，4 組不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)中，單煎與合煎樣品峰1 和峰4 的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而峰1、峰4 所表征的化學(xué)成分均來(lái)源于麻黃，猜測(cè)在合煎過(guò)程中，桂枝中溶出的某些物質(zhì)成分與麻黃中的峰1 和峰4 所表征的化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致峰1和峰4 的峰面積減小。因此有必要對(duì)峰1 和峰4 進(jìn)行指認(rèn)，明確其發(fā)揮的藥理/毒理作用。另外，麻黃、桂枝配伍比例為1 : 1 時(shí)，單煎與合煎樣品中峰2（鹽酸麻黃堿）、峰3（鹽酸偽麻黃堿）的“峰面積/稱(chēng)樣量”值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿是麻黃平喘的主要藥效成分[8]，此二者含量的差異極可能導(dǎo)致麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎臨床藥效的差異。

根據(jù)各共有峰“峰面積/稱(chēng)樣量”值的變化規(guī)律可推斷峰1-峰5、峰7-峰8 所表征的化學(xué)成分來(lái)源于麻黃，而峰6、峰9-峰11 所表征的化學(xué)成分來(lái)源于桂枝。麻黃、桂枝配伍比例為1 : 1 時(shí)，單煎與合煎樣品中麻黃化學(xué)成分含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明麻黃、桂枝配伍比例為1 : 1 時(shí)，對(duì)麻黃化學(xué)成分的溶出影響較大。4 組不同配伍比例麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品峰9、峰10、峰10的“峰面積/稱(chēng)樣量”值之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明麻黃、桂枝配伍比例對(duì)單煎與合煎樣品中桂枝化學(xué)成分含量影響不大。

4 結(jié)論

本研究建立的麻黃-桂枝藥對(duì)UPLC 指紋圖譜，方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。通過(guò)比較指紋圖譜中各共有峰“峰面積/稱(chēng)樣量”值，證實(shí)了不同配伍比例的麻黃-桂枝藥對(duì)單煎與合煎樣品中部分化學(xué)成分的含量存在差異，且麻黃、桂枝配伍比例是影響化學(xué)成分差異的重要因素。本研究可為單味中藥配方顆粒合用與群藥合煎的化學(xué)成分一致性研究提供參考。