基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討葶藶大棗瀉肺湯治療慢性肺心病的作用機制

李 倩，申鳳霞，馬 云，聶宗恒，范建偉，關(guān)永霞，張貴民

(1.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276005；2. 魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006）

慢性肺源性心臟?。–hronic pulmonary heart disease）是一類由慢性阻塞性肺病等疾病引起的肺組織結(jié)構(gòu)和功能異常，繼發(fā)心臟功能障礙的臨床綜合征，又名肺心病[1]，其臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、氣促、喘息等呼吸系統(tǒng)障礙，急性加重期則表現(xiàn)為呼吸衰竭、右心衰竭等[2]。肺心病的中老年發(fā)病率高，晚期存活率低，隨著環(huán)境嚴(yán)重污染以及老年化進程加快，該病患病率急劇上升。目前臨床治療肺心病主要針對患者肺部基礎(chǔ)疾病進行對癥治療，但只能減輕癥狀，無法改變疾病進程[3]。

肺心病按中醫(yī)理論屬本虛標(biāo)實之癥，歸屬于“肺脹”“痰飲”“水腫”等中醫(yī)范疇，本虛以肺、脾、腎氣虛為主，標(biāo)實以痰盛、水泛、血瘀為主，因此，辨證施治首推瀉肺除壅中藥[4]。葶藶大棗瀉肺湯首載于《金匱》卷上，又名“葶藶大棗湯”“葶藶瀉肺湯”，由葶藶子、大棗兩味藥組成，藥用歷史悠久，具有瀉肺行水、下氣平喘之功用[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葶藶大棗瀉肺湯具有緩解心衰癥狀、改善患者血流動力學(xué)等作用[6-7]，臨床上主要用于支氣管肺炎、心力衰竭等疾病的治療[8-9]。目前葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的研究缺乏足夠的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)，且其作用機制尚不明確。因此，本研究基于分子對接結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的策略，分析葶藶大棗瀉肺湯的主要活性成分和潛在靶標(biāo)，以期闡釋其可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機制，為臨床實踐提供較可靠的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葶藶大棗瀉肺湯藥效成分的收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫[10]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）檢索葶藶子和大棗，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為條件進行篩選，搜集葶藶大棗瀉肺湯的潛在藥效成分。

1.2 藥效成分對應(yīng)靶點庫和肺心病相關(guān)靶點庫的構(gòu)建

首先通過ChemBioDraw 軟件查詢潛在藥效成分的SMILES 字符串，并將其輸入SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫[11]中進行靶點預(yù)測，將所得靶點矯正統(tǒng)一后即得活性成分相關(guān)靶點信息。隨后以“Chronic pulmonary heart disease”為關(guān)鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲得慢性肺心病的相關(guān)靶點蛋白。最終將葶藶大棗瀉肺湯與慢性肺心病的靶點同時錄入“Venny 2.1 在線作圖工具平臺”上，繪制韋恩圖，取兩者的交集，得到葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的預(yù)測靶點。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和“藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將上述所得的共同靶點導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），并保存成TSV 格式的文件。將文件導(dǎo)入到Cytoscape V 3.6.1 軟件中，獲取葶藶大棗瀉肺湯治療慢性肺心病靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，隨后利用“Network Analyer”功能對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，以Degree 值為參考。將葶藶大棗瀉肺湯藥效成分和共同靶點同樣導(dǎo)入Cytoscape V 3.6.1 軟件，構(gòu)建“藥物-化學(xué)成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO（Gene Ontology）生物分析與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析

將上述潛在作用靶點輸入到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫中，獲得GO 生物功能富集和KEGG 通路分析，限定P＜ 0.05。GO 生物分析通過生物途徑（Biology process，BP）、分子功能（Molecular function, MF）、細胞組分（Cellular component，CC）三個方面進行說明與注釋。

1.5 關(guān)鍵蛋白和活性成分的分子對接驗證

在上述步驟基礎(chǔ)上，分別選取6 個關(guān)鍵靶點蛋白作為受體，葶藶大棗瀉肺湯中5 個關(guān)鍵藥效成分作為配體，進行分子對接驗證。首先在PDB 數(shù)據(jù)庫下載蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用Pymol 和Autodocktools 軟件對蛋白進行去水分子處理以及加氫加電荷等處理；在PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載活性分子的三維結(jié)構(gòu)，利用Autodock Vina 軟件進行分子對接驗證，對接參數(shù)設(shè)置為默認，根據(jù)分子與靶點的最低結(jié)合能進行分析驗證。

2 結(jié)果

2.1 葶藶大棗瀉肺湯藥效成分的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索得到葶藶子的藥效成分11 個、大棗的藥效成分17 個，有2 個重復(fù)化學(xué)成分，去重后最終得到26 個藥效成分。根據(jù)OB 值大小進行排列，具體信息見表1。

表1 葶藶大棗瀉肺湯中活性成分Tab. 1 Active ingredients of Tingli Dazao Xeifei decoction

2.2 藥效成分靶點與慢性肺心病靶點的檢索結(jié)果

通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫對葶藶大棗瀉肺湯中的26 個潛在活性成分進行靶點預(yù)測，將預(yù)測靶標(biāo)綜合篩選，保留唯一值，獲得771 個預(yù)測藥物靶點。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫查詢慢性肺心病的靶點，檢索得到1 576 個相關(guān)靶點，根據(jù)相關(guān)性進行排名，取前300 的靶點進行下一步分析。運用Venny 平臺將葶藶大棗瀉肺湯的靶點與慢性肺心病的治療靶點取交集，最終得到45 個共同靶點，見圖1。

圖1 葶藶大棗瀉肺湯與肺心病相關(guān)靶點韋恩圖Fig. 1 Wayne chart of target of Tingli Dazao Xeifei decoction and heart failure

2.3 “藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

“藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)見圖2，該網(wǎng)絡(luò)共包含73 個節(jié)點和362 條邊，圖中節(jié)點越大表明相互作用的節(jié)點越多，線條越多代表關(guān)聯(lián)度越大。將“葶藶大棗瀉肺湯-肺心病”45 個共同靶點導(dǎo)入STRING 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫，得到蛋白間的相互關(guān)系，繼而構(gòu)建共有靶點互相作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。通過Network Analyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲學(xué)性質(zhì)，伊夫雙苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K、β-谷甾醇關(guān)聯(lián)度較高，白介素-6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）、雌激素受體1（ESR1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）等靶點的關(guān)聯(lián)度較大，表明這些活性成分與靶點肺心病治療中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，體現(xiàn)出葶藶大棗瀉肺湯是多成分、多靶點的網(wǎng)絡(luò)體系。

圖2 “藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 Network diagram of "drug-compound-target"

圖3 45 個富集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 PPI network diagram of 45 enriched targets

2.4 GO 生物功能與KEGG 通路富集分析

將45 個共有靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行GO基因富集和KEGG 通路分析。GO 生物學(xué)功能中，相關(guān)條目最多的是生物學(xué)過程（BP），主要涉及254 個相關(guān)條目包括erk1 和erk2 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、基因表達負調(diào)控、MAPK 級聯(lián)激活和基因表達正調(diào)控等；其次是分子功能（MF），主要涉及52 個相關(guān)條目主要包括同一蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性等；最后是細胞組分（CC），主要涉及20 個相關(guān)條目包括細胞膜、受體復(fù)合物、細胞外空間和胞外區(qū)等。以P值作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別選取P值最小的前10 條進行展示，富集結(jié)果見圖4。

圖4 葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的GO 富集分析Fig. 4 Analysis of GO enrichment of Tingli Dazao Xiefei decoction in the treatment of pulmonary heart disease

KEGG 富集分析共有79 條相關(guān)通路，取前20位的結(jié)果形成KEGG 功能富集氣泡圖，用基因個數(shù)、P值和gene ratio 來衡量富集程度，見圖5。其中，P代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高；gene ratio 是目標(biāo)基因集中在這個通路的基因比率，gene ratio 越大，表示富集程度越高。結(jié)果顯示KEGG通路主要涉及缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、cGMP-PKG 信號通路（cGMPPKG signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等79 條相關(guān)通路。

圖5 葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的通路分析Fig. 5 Pathway analysis of Tingli Dazao Xiefei decoction in the treatment of pulmonary heart disease

2.5 分子對接驗證

利用Autidock Vina 軟件對6 個關(guān)鍵靶點蛋白及葶藶大棗瀉肺湯中5 個關(guān)鍵藥效成分進行分子對接驗證，并記錄分子與靶點的最低結(jié)合能，對接靶點及配體信息，見表2。葶藶大棗瀉肺湯中關(guān)鍵藥效成分與靶點蛋白結(jié)合普遍較好，均小于5 KJ/mol，其中，IL-6、VEGFA、TERT 等蛋白與伊夫雙苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K、β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿結(jié)合能較低，具有較強的結(jié)合能力，對接結(jié)果見表3、圖6-圖8。

圖6 IL-6 與伊夫雙苷（A）、毒毛旋花子苷元（B）、毒毛旋花K（C）、β-谷甾醇（D）、左旋千金藤啶堿（E）的分子對接結(jié)果Fig. 6 The molecular docking results of IL-6 and Erysimoside (A), Cynotoxin (B), K-Strophanthoside (C), β-Sitosterol (D) and Stepholidine (E)

圖8 TERT 與伊夫雙苷（A）、毒毛旋花子苷元（B）、毒毛旋花K（C）、β-谷甾醇（D）、左旋千金藤啶堿（E）的分子對接結(jié)果Fig. 8 The molecular docking results of TERT and Erysimoside (A), Cynotoxin (B), K-Strophanthoside (C), β-Sitosterol (D) and Stepholidine (E)

表2 對接靶點及配體信息Tab. 2 Docking target and ligand information

表3 葶藶大棗瀉肺湯關(guān)鍵藥效成分及靶點蛋白的分子對接作用結(jié)果Tab. 3 Results of molecular docking of key medicinal components and key targets of Tingli Dazao Xiefei decoction

3 討論

肺心病癥狀早在《素問》中即有描述，如“肺痹者，煩滿喘而嘔”“肺之壅，喘而兩胠滿”“夫不得臥，臥則喘者，是水氣之客也”[12]，由此可見中醫(yī)講肺心病從肺治的道理所在。本研究中葶藶子入肺經(jīng)，主清肺祛痰，降氣平喘，同時其活性成分有明顯的強心作用[13]，大棗補中益氣，有緩和肺氣之功用，故兩者合用十分適用于慢性肺心病的喘息水腫證，可視作慢性肺心病的有效藥物。

圖7 VEGFA 與伊夫雙苷（A）、毒毛旋花子苷元（B）、毒毛旋花K（C）、β-谷甾醇（D）、左旋千金藤啶堿（E）的分子對接結(jié)果Fig. 7 The molecular docking results of VEGFA and Erysimoside (A), Cynotoxin (B), K-Strophanthoside (C), β-Sitosterol (D) and Stepholidine (E)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出葶藶大棗瀉肺湯26 個潛在活性成分及45 個活性靶點，經(jīng)分子對接驗證，度值較高的前6 個關(guān)鍵靶點蛋白與5 個關(guān)鍵藥效成分均顯示出較強的結(jié)合能力，體現(xiàn)了葶藶大棗瀉肺湯多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮作用的特點。研究表明，伊夫雙苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K是葶藶子中強心苷類物質(zhì)，能增強心室心肌泵血功能，增加冠脈流量，具有強心作用[14]。β-谷甾醇通過抑制IL-6 活性，減少炎癥因子分泌，能夠緩解肺組織損傷，同時具有鎮(zhèn)咳祛痰、舒張支氣管平滑肌的作用[15]。左旋千金藤啶堿能夠增加心肌收縮力，緩解心衰癥狀[16]。由PPI 互作網(wǎng)絡(luò)及分子對接驗證，葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的核心靶點為：IL-6、VEGFA、AKT1、TERT、ESR1、MMP2。IL-6 是一種由多種細胞分泌的炎性因子，有研究發(fā)現(xiàn)，肺心病患者體內(nèi)IL-6 含量明顯高于正常志愿者，炎癥反復(fù)可導(dǎo)致肺組織纖維化[17]。VEGFA 作為內(nèi)皮生長因子，能夠促進動脈壁平滑肌增生肥厚，導(dǎo)致血管彈性下降并血管腔狹窄，易引起肺動脈高壓[18]。AKT1負責(zé)調(diào)控細胞增殖生長，能夠加強表達促心肌細胞重構(gòu)及纖維化，能夠加重心衰病情[19]。TERT 是一類與癌癥相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶，有研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者體內(nèi)TERT 含量明顯升高，并隨著心衰發(fā)病有一定波動[20]。由此可知葶藶大棗瀉肺湯可能通過IL-6、VEGFA、AKT1、TERT 等靶點，發(fā)揮抗炎、抗心衰、減緩心肌纖維化等作用。

GO 功能及KEGG 富集分析可知，葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病主要通過HIF-1 信號通路、cGMPPKG 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等通路。多項研究[21]表明HIF-1 能夠控制氧的輸送和利用，使心肌細胞達到氧穩(wěn)態(tài)，對于心肌缺氧損傷細胞發(fā)揮保護作用。玄春花等[22]研究表明慢性肺心病可致cGMPPKG 信號傳導(dǎo)中斷，導(dǎo)致患者心肌肥厚、縮舒功能不全以及硬化等惡行病變。另有研究證明，PI3K/AKT 信號通路及通路中的眾多受體和激酶與心力衰竭有著密切的聯(lián)系，能夠調(diào)控炎癥細胞活化、炎性介質(zhì)合成和釋放，增強血管生成，抑制細胞凋亡因子[23]。

4 結(jié)論

本研究基于中醫(yī)整體觀念和現(xiàn)代整合藥理學(xué)思路，對葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的潛在活性成分、作用靶點及相關(guān)通路等進行初步探討及驗證篩選，結(jié)果表明伊夫雙苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K、β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿等潛在活性成分可能通過HIF-1 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、PI3K-Akt等信號通路作用于IL-6、VEGFA、AKT1、TERT、ESR1、MMP2 等核心靶點，共同發(fā)揮抗炎、增強心肌作用、保護肺心功能等作用，為深入研究葶藶大棗瀉肺湯治療肺心病的活性成分及機制提供了一定的科學(xué)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。