基于分子對(duì)接技術(shù)探討中藥抑制幽門螺旋桿菌脲酶(HPU)活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及規(guī)律

歐海亞，葉小鵬，徐旖琪，劉嘉輝，鄺衛(wèi)紅

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518133；2. 廣東醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524000 ；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東 廣州 510080）

幽門螺旋桿菌是一種微需氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，因其具有傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)也被歸屬于傳染病范疇[1]。幽門螺旋桿菌主要定植在人的胃粘膜，通過產(chǎn)生大量脲酶（Helicobacter pyloriurease，HPU）促進(jìn)其表面形成保護(hù)性液膜并催化尿素產(chǎn)生氨中和胃酸，使其能夠適應(yīng)胃部強(qiáng)酸環(huán)境并存活。此外，HPU可通過增強(qiáng)胃黏膜的通透性和破壞胃壁細(xì)胞發(fā)揮毒力作用，故被認(rèn)為是幽門螺旋桿菌在胃內(nèi)存活及致病的關(guān)鍵蛋白[2]。

目前，我國(guó)已有超過50%的人感染幽門螺旋桿菌。臨床研究表明，幽門螺旋桿菌是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等消化道疾病的重要致病因素，也是一類致癌因子[3]。因此，及時(shí)、徹底地根除幽門螺旋桿菌可在一定程度上降低上述疾病發(fā)生的概率。目前，國(guó)內(nèi)共識(shí)推薦的首選治療方案為經(jīng)驗(yàn)性使用含鉍劑的四聯(lián)抗幽門螺旋桿菌根除方案，但因抗生素耐藥性、藥物副作用等因素導(dǎo)致根除成功率逐漸下降[1-4]，因此研發(fā)高效低毒的優(yōu)化方案根除幽門螺旋桿菌是目前亟需攻克的問題。

中藥是天然的化合物寶庫，具有成分多、作用平穩(wěn)、安全性較高等特點(diǎn)，辨證論治使用中藥治療胃腸道疾病效果較佳，且多項(xiàng)研究顯示中藥及復(fù)方具有提高幽門螺旋桿菌的根除率以及減少抗生素副作用的功效[5-7]，這表明中藥可為抗幽門螺旋桿菌方案的優(yōu)化提供潛在選擇，而HPU 是幽門螺旋桿菌存活及致病的關(guān)鍵蛋白，因此挖掘具有抑制HPU 活性作用的單體、中藥、復(fù)方對(duì)藥物研發(fā)以及發(fā)揮中醫(yī)藥抗幽門螺旋桿菌優(yōu)勢(shì)具有重要的價(jià)值。然而，目前通過實(shí)驗(yàn)或臨床研究發(fā)現(xiàn)的具有抑制HPU 活性的中藥及單體較少，加之中藥及所含化合物數(shù)量巨大，逐一成分研究則存在研究周期長(zhǎng)、資金成本大等問題，故暫無有關(guān)系統(tǒng)評(píng)估及挖掘可抑制HPU 活性的中藥單體、中藥及中藥組方等方面的研究。

分子對(duì)接是一種普遍應(yīng)用于藥物設(shè)計(jì)的技術(shù)，可通過模擬計(jì)算配體受體間親和力以及結(jié)合模式從而評(píng)估相互作用可能性大小以及復(fù)合物之間的穩(wěn)定性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)識(shí)別苗頭分子及篩選分子等功能，目前廣泛用于發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化先導(dǎo)化合物等領(lǐng)域[8-9]。本研究基于分子對(duì)接的方法，擬初步篩選出具有抑制HPU 活性潛能的中藥小分子及相關(guān)中藥，闡述中藥抑制HPU 活性的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)以及一般規(guī)律，為進(jìn)一步開發(fā)可靠的中藥先導(dǎo)化合物以及針對(duì)幽門螺旋桿菌感染相關(guān)疾病的臨床用藥提供思路以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥小分子化合物的獲取以及小分子配體數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

本研究通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）, 獲取其所收錄的小分子化合物信息并下載所有小分子的三維結(jié)構(gòu)*.MOL2 格式文件。篩選出符合口服利用度（Oral bioavailability, OB）≥30%且類藥性（Drug likeness, DL）≥0.18 兩個(gè)條件的小分子化合物用以構(gòu)建中藥小分子配體數(shù)據(jù)庫。借助Autodock tools 1.5.6軟件將配體數(shù)據(jù)庫中的小分子計(jì)算電荷后保存為*. pdbqt 格式文件。

1.2 靶點(diǎn)分子結(jié)構(gòu)的獲取及預(yù)處理

通過PDB 數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org/)下載HPU 的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB 代碼：1E9Y，分辨率為3.00?），借助Pymol 1.7.X 軟件及Autodock tools 1.5.6 軟件將1E9Y 中原有小分子配體刪除并去掉水分子，經(jīng)添加極性氫、合并非極性氫、賦予電荷優(yōu)化晶體結(jié)構(gòu)后保存為*.pdbqt 格式文件。

1.3 構(gòu)建對(duì)接模型及分子對(duì)接

借助分子對(duì)接軟件Autodock Vina 將HPU 與配體數(shù)據(jù)庫中的小分子進(jìn)行分子對(duì)接，并獲取各配體的結(jié)合能（Affinity）打分，其中，對(duì)接結(jié)合能打分是Autodock Vina 軟件基于半經(jīng)驗(yàn)半自由能的打分方法，該值與結(jié)合強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[10]。研究表明HPU 催化活性區(qū)域以鎳離子（Ni2+）為中心，包含多個(gè)氨基酸殘基及水分子，故本次分子對(duì)接將對(duì)接活性口袋Grid box 坐標(biāo)中心設(shè)置為兩個(gè)鎳離子坐標(biāo)的平均值[11]，活性口袋大小設(shè)置為（30, 30, 30），格點(diǎn)間隔則設(shè)置為默認(rèn)值[12-13]。對(duì)接過程中每個(gè)小分子化合物均獲取20 種構(gòu)象，選取各受體-配體結(jié)合最佳結(jié)合的構(gòu)象（結(jié)合能最低）作進(jìn)一步分析，并借助Discovery Studio 2016 Visualizer 軟件進(jìn)行可視化。

1.4 構(gòu)建候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)以及整理并統(tǒng)計(jì)中藥數(shù)據(jù)信息

以最低結(jié)合能小于等于-8 Kcal/mol 為閾值進(jìn)一步篩選出與HPU 結(jié)合潛力大的中藥小分子，將其定義為候選化合物，并從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中匹配出含有候選化合物的中藥。通過軟件Cytoscape 3.6.1 構(gòu)建候選化合物—中藥網(wǎng)絡(luò)并分析網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)（node）的度值（degree）。通過查詢衛(wèi)生部“十二五”規(guī)劃教材 《中藥學(xué)》[14]以及從《中國(guó)藥典》（2020 年版）獲取中藥的歸經(jīng)以及性味等信息并進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，初步探索抑制HPU 活性的一般規(guī)律。

2 結(jié)果及分析

2.1 化合物獲取結(jié)果

通過檢索 TCMSP 數(shù)據(jù)庫共獲取中藥小分子化合物13 724 個(gè)及相關(guān)中藥502 味，以O(shè)B ≥30%及DL ≥0.18 為條件進(jìn)行篩選后，共納入配體數(shù)據(jù)庫的中藥小分子為2 583 個(gè)。將配體庫中的小分子與HPU 進(jìn)行分子對(duì)接后，發(fā)現(xiàn)配體庫中各小分子最低結(jié)合能介于-9.50 ～-4.00 Kcal/mol 之間，中位數(shù)為-6.7 Kcal/mol，配體庫中的小分子最低結(jié)合能分布情況詳見圖1。

圖1 配體最低結(jié)合能分布圖Fig. 1 Distribution of the lowest binding energy of the ligand

2.2 候選化合物對(duì)接結(jié)果

以最低結(jié)合能≤-8 Kcal/mol 為界限，共篩選出候選化合物99 個(gè)，其中，最低結(jié)合能由低至高排前6 的小分子化合物為（E, E)-3, 5-Di-O-caffeoylquinic acid、bisindigotin、mulberrofuran G、6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one、procyanidin B-5, 3'-O-gallate、chaksine，其分值依次為-9.5 Kcal/mol、-9.1 Kcal/mol、-9.1 Kcal/mol、-8.9 Kcal/mol、-8.9 Kcal/mol、-8.9 Kcal/mol，將結(jié)合能最低的6 個(gè)配體-受體復(fù)合物進(jìn)行可視化如圖2 所示。圖中顯示六種中藥小分子均能穩(wěn)定的對(duì)接到HPU 的活性口袋中，對(duì)接2D 結(jié)構(gòu)示意圖顯示配體小分子除可與HPU 活性口袋周圍Asp223、Ala365、Thr171、Cys321 等氨基酸殘基形成氫鍵作用外，亦可形成靜電作用及疏水作用，由此提示結(jié)合能低的分子可與HPU 形成多種相互作用力而具有潛在的抑制作用，可供進(jìn)一步開發(fā)研究。從 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中匹配出候選化合物相關(guān)中藥104 種，其中，最低結(jié)合能≤-8.6 Kcal/mol 的候選分子及所匹配的中藥，見表1，可知續(xù)斷、蓼大青葉、青黛、桑白皮、板藍(lán)根、大青葉等中藥含與HPU 結(jié)合能低的小分子，提示這些中藥潛在抑制HPU 活性從而具有抗幽門螺旋桿菌前景，可供臨床治療幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性疾病提供借鑒。

表1 部分候選分子信息（最低結(jié)合能≤ -8.6 Kcal/mol）及相關(guān)的中藥Tab. 1 Some of the candidate molecules（Affinity ≤-8.6 Kcal/mol）and related Chinese medicines

圖2 6 個(gè)結(jié)合能最低的配體-受體復(fù)合物作用模式圖Fig. 2 Diagram of the action mode of the 6 ligand-receptor complexes with the lowest affinity

2.3 候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將候選化合物以及中藥導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件后得候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有203 個(gè)節(jié)點(diǎn)（node），其中候選化合物節(jié)點(diǎn)有99 個(gè)，中藥節(jié)點(diǎn)104 個(gè)，如圖3 所示，圖中綠色六邊形為候選化合物節(jié)點(diǎn)，淡紅色菱形為中藥節(jié)點(diǎn)，圖中各節(jié)點(diǎn)大小與度值成正相關(guān)關(guān)系。中藥節(jié)點(diǎn)度值排前4 的為白屈菜、苦地丁、甘草、洋金花，分別含有6、6、5、5 個(gè)候選化合物，其中，度值前16 的中藥如表2 所示,這些中藥所含候選化合物較多，提示這些中藥具有多成分協(xié)同抑制HPU 活性的潛力。

圖3 候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Interactional network of candidate compounds and Chinese medicines

表2 候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)中部分中藥節(jié)點(diǎn)度值表（度值前16）Tab. 2 Degree of herb nodes in the network of candidate compoundsherbs (degree top 16)

2.4 中藥性味與歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

通過收集候選化合物相關(guān)中藥的性味歸經(jīng)等信息并進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)從而分析中藥的一般規(guī)律，其中，了哥王根、茄根、葎草、馬尾蓮等4 味中藥暫未被《中藥學(xué)》及《中國(guó)藥典》所收錄，故暫不予以納入統(tǒng)計(jì)。中藥性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表3 和圖4，其中，表3 顯示潛在抗幽門螺旋桿菌的中藥藥味最高頻率為苦味，為39.43%，其次為甘味、辛味，此三種藥味累計(jì)頻率可達(dá)89.43%；藥性方面以寒性中藥數(shù)目最多，頻率為47.80%。就歸經(jīng)而言，排前四的經(jīng)絡(luò)歸屬依次為肝、肺、胃、脾，出現(xiàn)頻率為20.84%、19.26%、16.62%、10.82%，累計(jì)達(dá)67.55%。頻數(shù)分析結(jié)果顯示，通過抑制HPU 活性實(shí)現(xiàn)抗幽門螺旋桿菌作用的中藥以苦寒藥物居多，且其抑制作用的實(shí)現(xiàn)不僅與脾經(jīng)、胃經(jīng)相關(guān)，還與肝、肺二經(jīng)關(guān)系緊密。

表3 中藥的性味分布表Tab. 3 Distribution diagram of the property and flavor of Chinese medicines

圖4 藥物經(jīng)絡(luò)歸屬分布圖Fig. 4 Distribution diagram of channel attribution

3 討論

HPU 是一種含Ni2+的金屬酶，是幽門螺旋桿菌存活及致病的關(guān)鍵蛋白，其發(fā)揮催化尿素的功能主要依賴于以Ni2+為中心的活性區(qū)域，但同時(shí)也與活性中心上方控制底物出入的flap 區(qū)域有關(guān)[15]。研究表明flap 區(qū)域中多種重要?dú)埢鏑ys321、His322、His221、Met366、Asp362、Alal69、Asnl68、Ala365負(fù)責(zé)氫鍵作用[16]，其中，Cys321 殘基則是影響flap區(qū)域的一個(gè)重要基團(tuán)[17]。而HPU 活性中心則包含2 個(gè)Ni2+原子，2 個(gè)水分子以及His136、His248、His274、His138、Kcx219、Asp362 等氨基酸殘基[13]。分子對(duì)接結(jié)果顯示MOL011100、MOL012726、MOL001810、MOL002260、MOL004450 等小分子可與flap 區(qū)域周圍的Cys321、Ala365、Asp362、Ile220、Thr171 等殘基形成潛在的氫鍵作用，與flap區(qū)域周圍的Asp223、Ala365、Thr171、Cys321 等殘基形成疏水等多種作用力，這表明上述候選化合物具有作用于flap 區(qū)域的潛力，通過多樣的分子間作用力在flap 區(qū)域與HPU 形成復(fù)合物從而減少或阻斷尿素出入。此外，MOL009312 等候選化合物也可與活性中心的Asp362、His248 等多個(gè)殘基形成氫鍵、范德華力等作用力，提示部分中藥小分子也可競(jìng)爭(zhēng)性進(jìn)入酶活性中心，改變HPU 活性區(qū)域構(gòu)象從而降低其催化活性。就中藥而言，含有與HPU 結(jié)合能力較佳的候選化合物的中藥具有抑制HPU 活性的潛能，從而能對(duì)幽門螺旋桿菌產(chǎn)生抑制作用。其中，黃連、黃芩、大黃、黨參、延胡索、胡椒、白屈菜已被證明對(duì)幽門螺旋桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，與本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果相符，提示本研究借助分子對(duì)接的方法篩選出的具有抑制幽門螺旋桿菌潛能的小分子及中藥可信度較高，值得進(jìn)一步探索和開發(fā)[5]。

候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)中，白屈菜及苦地丁含有較多的候選化合物，提示這兩種中藥在抗幽門螺旋桿菌方面具有較好的臨床應(yīng)用前景，可進(jìn)一步挖掘。研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜及苦地丁的主要成分為生物堿，苦地丁含有黃連堿，而白屈菜則含有黃連堿以及小檗堿，這兩種生物堿均對(duì)幽門螺旋桿菌敏感且對(duì) HPU 活性抑制能力較強(qiáng)[18-19]，這也對(duì)本研究中分子對(duì)接篩選出的中藥具有抑制幽門螺旋桿菌的潛能提供了證據(jù)支持。值得注意的是，這兩種中藥中仍有多種生物堿與HPU 的結(jié)合能低于黃連堿及小檗堿，但暫無這些小分子抑制 HPU 活性的相關(guān)報(bào)道，這也是今后可以進(jìn)一步探索的方向。此外，大黃、甘草、兩面針等度值較高的中藥對(duì)幽門螺旋桿菌的抑制作用均已得到驗(yàn)證[20]，可為臨床辨證施治提供藥理依據(jù)。同時(shí)，度值高的中藥含有多種潛在有效成分，提示這些中藥具有多功能物質(zhì)協(xié)同作用的特點(diǎn)，可降低使用單一成分產(chǎn)生的耐藥率，多種有效成分協(xié)同抗菌亦可減少單一藥物用量從而降低毒副作用。由此可知，中藥在抑制幽門螺旋桿菌方面具有多功能協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)。

性味歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，具有潛在抑制HPU 活性的中藥中，從性味方面而言，苦、甘、辛三種藥味共占89.43%，其中，苦能燥、能瀉，具有燥濕以及通瀉、降瀉、清瀉的功效，甘能補(bǔ)、和、緩，具有和中補(bǔ)益的功效，而辛味藥具有發(fā)散、行氣血的功效，以藥測(cè)證可初步推測(cè)出幽門螺旋桿菌感染相關(guān)疾病中出現(xiàn)較頻繁的證素為熱、濕、虛、氣滯、血瘀；從歸經(jīng)方面而言，包含候選化合物的中藥歸肝、肺、脾、胃經(jīng)居多，其中，肝、肺二經(jīng)協(xié)調(diào)對(duì)調(diào)暢全身氣血至關(guān)重要。綜上所述，由用藥規(guī)律可推測(cè)感染幽門螺旋桿菌后，辨證施治應(yīng)著重清熱、調(diào)理氣血及脾胃。

4 結(jié)論

本研究從蛋白水平出發(fā)，將 HPU 作為研究靶點(diǎn)，借助分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)小分子與靶點(diǎn)之間的作用模式，篩選出具有抑制 HPU 活性潛能的候選化合物及其對(duì)應(yīng)的中藥，并系統(tǒng)地探討了中藥抑制 HPU 活性的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及一般規(guī)律，可為中西醫(yī)結(jié)合臨床辨證用藥提供理論依據(jù)，以及為進(jìn)一步挖掘抗幽門螺旋桿菌藥物提供方向，具有重要的研究意義。然而，本研究數(shù)據(jù)主要從數(shù)據(jù)庫以及分子模擬計(jì)算獲得，暫未考慮數(shù)據(jù)庫收錄是否全面、最低抑制劑量、抑制強(qiáng)度以及中藥煎煮方式等因素對(duì)結(jié)果所帶來的影響，因而仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或臨床驗(yàn)證。