腦脈利顆粒對大鼠下肢動脈硬化閉塞癥影響的研究

蘇 梅，婁雅靜，王 姍，秦引林

（江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 南京 210016）

動脈硬化閉塞癥（Arteriosclerosis obliterans，ASO）是在動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上發(fā)展而來的慢性動脈閉塞疾病，多見于下肢動脈，可引起間歇性跛行、靜息痛、潰瘍、壞疽[1-2]。ASO 多發(fā)生于50 歲以上人群，發(fā)病率約0.74%，嚴重威脅著人們的健康生活[3]，迫切需要尋找一種安全有效的治療方法。ASO 的病因尚未明確，目前普遍認為脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)激活是ASO 發(fā)生發(fā)展過程中最基本的病理環(huán)節(jié)，能夠促進動脈硬化、加劇管腔狹窄[4-6]。針對性的進行內(nèi)皮保護、抗炎和降血脂治療是目前ASO 干預(yù)的主要靶點。因此，尋找一種具有內(nèi)皮保護、抗炎和降脂作用的藥物來治療ASO 可能是一種有效的策略。同時，《下肢動脈硬化閉塞癥診治指南》的中醫(yī)中藥治療指出[7]，中醫(yī)以辨證論治為主，活血化瘀法貫穿始終，配合活血化瘀藥物，以建立側(cè)支循環(huán)，改善肢體血運。

腦脈利顆粒是以三七、黃芪、川穹、紅花、丹參、當歸、益母草等組成的中藥復(fù)方制劑。組方中三七、姜黃、丹參、川芎、紅花等具有很好的抗炎、活血祛瘀的作用，白芍、三七、丹參、益母草等對血管內(nèi)皮有一定的保護作用，其抗炎、活血祛瘀和改善血管內(nèi)皮功能的作用與治療ASO 的策略較為契合[8]。目前腦脈利顆粒在臨床上用于治療氣虛血瘀型腦卒中病中經(jīng)絡(luò)急性期，改善半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜、語言蹇澀等癥狀[8-9]。但是關(guān)于腦脈利顆粒在治療ASO 方面的研究尚未見報道。因此，本研究建立了高脂飼料喂養(yǎng)加隱動脈內(nèi)膜損傷的藥效模型，通過檢測下肢動脈血流情況、下肢動脈狹窄情況以及血清中血脂水平、炎癥因子和血管內(nèi)皮相關(guān)指標來研究腦脈利顆粒治療ASO 的藥理作用，為臨床提供更有價值的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 腦脈利顆粒（ 批號：11-191010，南京柯菲平盛輝制藥有限公司）；西洛他唑片（批號：200704P，浙江大冢制藥有限公司）。

1.1.2 實驗動物 SPF 級成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為（200 ± 20）g，購自杭州醫(yī)學(xué)院，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。

1.1.3 試劑 甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、一氧化氮（NO）檢測試劑盒，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮素（ET-1） 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 LEGEND Micro 21R 型微量離心機（美國賽默飛世尓科技公司）；Heracell 型150i CO2培養(yǎng)箱 （美國賽默飛世尓科技公司）；CX21 型奧林巴斯顯微鏡（日本奧林巴斯醫(yī)療公司）；moorFLPI-2 型激光散斑血流成像系統(tǒng)（英國摩爾儀器）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠ASO 模型 采用高脂飲食加隱動脈內(nèi)膜損傷的方法制作大鼠ASO 模型。SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，1%戊苯巴比妥鈉（1 mL/200 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定于手術(shù)臺上。每只大鼠均取左后肢消毒。從腹股溝中點向膝下縱行切開皮膚，分離并暴露股動脈至膝部腘動脈分叉處，用小動脈夾阻斷股動脈遠、近端共1.5 ～ 2.0 cm，取0.1 mL 注射器1 支，接特制玻璃穿刺針沿股動脈血管長軸從近端刺入，將0.2 ～ 0.3 mL 注射用無菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管，至血管充盈為止。5 min后取下針頭和動脈夾，止血、縫合。同時給予維生素D3（30 萬U/kg），右后肢肌肉注射，1 次/月，共計12 周。

1.2.2 實驗分組 24 只成年雄性SD 大鼠被隨機分為：假手術(shù)組、ASO 模型組、腦脈利顆粒低劑量組（100 mg/kg）、腦脈利顆粒高劑量組（300 mg/kg）和西洛他唑組（10 mg/kg）。假手術(shù)組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動脈，不進行隱動脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口。每天灌胃蒸餾水1 次，喂食正?；A(chǔ)飼料12 周。ASO 模型組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動脈，進行隱動脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4 周后，開始每天灌胃蒸餾水1 次，并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。腦脈利顆粒低劑量組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動脈，進行隱動脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4 周后，開始每天灌胃腦脈利顆粒藥液1 次（給藥量：100 mg/kg），并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。腦脈利顆粒高劑量組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動脈，進行隱動脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4周后，開始每天灌胃腦脈利顆粒藥液1 次（給藥量：300 mg/kg），并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。西洛他唑組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動脈，進行隱動脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4 周后，開始每天灌胃西洛他唑藥液1 次（給藥量：10 mg/kg），并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。

1.2.3 檢測下肢動脈平均血流速度 喂食12 周后，使用異氟烷麻醉大鼠，大鼠麻醉后，對大鼠左后肢進行脫毛處理。完成脫毛后，使用激光散斑血流成像系統(tǒng)檢測各組大鼠下肢動脈血流情況。

1.2.4 檢測下肢動脈血管狹窄 喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，處死大鼠，并取出左后肢動脈，固定于多聚甲醛中，通過HE 染色和EVG 染色觀察各組大鼠下肢動脈狹窄。

1.2.5 檢測脂質(zhì)水平 喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，眼眶取血，離心，收集血清，并將血清保存在-20 ℃中備用。分別使用TG、TC、LDL 和HDL 試劑盒檢測血清中TG、TC、LDL 和HDL 的含量。

1.2.6 檢測炎癥因子水平 喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，眼眶取血，離心，收集血清，并將血清保存在-20 ℃中備用。分別使用TNF-α、IL-1β 和IL-6 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量。

1.2.7 檢測血管內(nèi)皮功能 通過檢測血清中NO、VEGF 和ET-1 水平來反應(yīng)各組大鼠血管內(nèi)皮功能狀況。喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，眼眶取血，離心，收集血清，并將血清保存在-20 ℃中備用。分別使用NO 含量檢測試劑盒、VEGF 和ET-1 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清中NO、VEGF 和ET-1 的含量。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差 （x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 腦脈利顆粒對下肢動脈硬化閉塞癥大鼠的下肢動脈血流速度的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組血流速度明顯降低（P＜0.01），表明造模成功。與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠下肢動脈血流速度均明顯升高（P＜0.01），高劑量的腦脈利顆粒的藥效與西洛他唑相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表1。

圖1 各組動物下肢動脈血流速度圖的比較Fig. 1 Comparison of lower limb arterial blood rate in each group

表1 各組動物下肢動脈血流速度比較結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 1 Comparison of lower limb arterial blood rate in each group（±s，n = 6）

表1 各組動物下肢動脈血流速度比較結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 1 Comparison of lower limb arterial blood rate in each group（±s，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，**P ＜0.01。

組別平均血流速度/（mm/s）假手術(shù)組254.18 ± 18.88 ASO 模型組 35.29 ± 4.53##腦脈利顆粒低劑量組 140.79 ± 14.20**腦脈利顆粒高劑量組 240.79 ± 20.28**西洛他唑組 214.24 ± 16.33**F 65.260 P 0.000

2.2 腦脈利顆粒對下肢動脈硬化閉塞癥大鼠的下肢動脈狹窄癥狀的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠下肢動脈出現(xiàn)嚴重的狹窄的現(xiàn)象。與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組都可以減輕下肢動脈硬化閉塞癥大鼠的下肢動脈狹窄，腦脈利顆粒高劑量組的藥效與西洛他唑組相當，各組HE 染色和EVG 染色結(jié)果，分別見圖2、圖3。

圖2 各組HE 染色結(jié)果Fig. 2 The results of hematoxylin-eosin stain in each group

圖3 各組EVG 染色結(jié)果Fig. 3 The results of elastic van gieson stain in each group

2.3 腦脈利顆粒對下肢動脈硬化閉塞癥大鼠的血脂紊亂現(xiàn)象的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠的TC、TG 和LDL 均明顯升高（P＜0.01），而HDL 明顯降低（P＜0.01），表明造模成功。與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠的TC、TG 和LDL 含量均降低（P＜0.05），HDL 含量升高（P＜0.05）。腦脈利顆粒高劑量組對ASO 大鼠血脂紊亂改善的藥效與西洛他唑組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組動物血脂水平比較（±s，mmol/L，n = 6）Tab. 2 Comparison of blood lipid levels in each group （±s，mmol/L，n = 6）

表2 各組動物血脂水平比較（±s，mmol/L，n = 6）Tab. 2 Comparison of blood lipid levels in each group （±s，mmol/L，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別TCTGLDLHDL假手術(shù)組3.52 ± 0.320.62 ± 0.05162.55 ± 14.4593.97 ± 4.99 ASO 模型組 7.56 ± 0.57## 0.96 ± 0.06## 339.26 ± 23.89## 65.41 ± 5.49##腦脈利顆粒低劑量組 5.85 ± 0.15** 0.76 ± 0.02* 278.21 ± 16.02*77.34 ± 3.16腦脈利顆粒高劑量組 4.63 ± 0.45** 0.67 ± 0.04** 206.42 ± 14.20** 86.35 ± 4.96**西洛他唑組 4.21 ± 0.35** 0.72 ± 0.03** 235.12 ± 15.58** 83.28 ± 5.96*F 33.26019.06064.97010.440 P 0.000 0.000 0.000 0.001

2.4 腦脈利顆粒對下肢動脈硬化閉塞癥大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠的TNF-α、IL-1β 和IL-6 均明顯升高（P＜0.01），表明造模成功；與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠的TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量明顯降低 （P＜0.01），腦脈利顆粒高劑量組藥效與西洛他唑組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組動物體內(nèi)炎癥因子水平比較（±s，ng/L，n = 6）Tab. 3 Comparison of inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n = 6）

表3 各組動物體內(nèi)炎癥因子水平比較（±s，ng/L，n = 6）Tab. 3 Comparison of inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，**P ＜0.01。

組別TNF-α IL-1β IL-6假手術(shù)組157.23 ± 11.4189.74 ± 9.2096.83 ± 6.53 ASO 模型組 503.58 ± 18.96## 211.32 ± 12.84## 236.83 ± 10.39##腦脈利顆粒低劑量組 300.12 ± 22.07** 170.66 ± 6.71** 163.50 ± 10.17**腦脈利顆粒高劑量組 260.43 ± 25.85** 117.32 ± 10.29** 128.05 ± 11.30**西洛他唑組 290.21 ± 23.70** 136.89 ± 7.09** 133.89 ± 11.71**F 71.87049.61054.260 P 0.000 0.000 0.000

2.5 腦脈利顆粒對下肢動脈硬化閉塞癥大鼠的血管內(nèi)皮功能紊亂的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠的NO 和VEGF 均明顯降低 （P＜0.01）；而ET-1 明顯升高（P＜0.01），表明造模成功；與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠的NO 和VEGF 含量均升高（P＜0.05），ET-1 含量明顯降低（P＜0.01）。腦脈利顆粒高劑量組對ASO 大鼠血管內(nèi)皮功能紊亂改善的藥效與西洛他唑組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組動物血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標檢測結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 4 The results of related indexes of vascular endothelial function in each group（±s，n = 6）

表4 各組動物血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標檢測結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 4 The results of related indexes of vascular endothelial function in each group（±s，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別NO/ （μmol/L）ET-1/ （ng/L）VEGF/ （ng/L）假手術(shù)組21.44 ± 2.6427.10 ± 2.0939.39 ± 1.93 ASO 模型組 12.44 ± 2.10## 82.67 ± 4.46## 20.75 ± 2.50##腦脈利顆粒低劑量組 17.18 ± 1.13* 53.97 ± 7.81**27.81 ± 2.08腦脈利顆粒高劑量組 19.51 ± 0.63** 46.65 ± 4.06** 33.89 ± 3.73**西洛他唑組 18.19 ± 0.45* 49.32 ± 4.36** 31.74 ± 3.56*F 8.58333.09011.950 P 0.003 0.000 0.000

3 討論

實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠下肢動脈血管內(nèi)膜損傷并異常增殖，造成血管狹窄、平均血流速度下降；血清中的NO 和VEGF 含量降低，ET-1 含量升高，炎癥水平升高；脂質(zhì)代謝紊亂，說明造模成功，可用于腦脈利顆粒對于大鼠下肢動脈硬化閉塞癥治療效果的評估。

與模型組相比，腦脈利顆粒組可以升高下肢動脈血流速度，同時HE 和EVG 染色結(jié)果顯示腦脈利顆粒組均可有效改善下肢動脈狹窄，從而改善血循環(huán)和肢體血運，達到舒經(jīng)活絡(luò)的目的。臨床上，改善下肢動脈硬化閉塞癥患者血流速度和血管內(nèi)徑，可提高臨床療效[10]。

研究表明，動脈硬化閉塞癥的發(fā)展歷程為氧化型LDL 沉積于動脈內(nèi)膜下（損傷處尤為明顯），與巨噬細胞及血管平滑肌細胞表面的清道夫受體結(jié)合，致使細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，形成泡沫細胞，并與內(nèi)皮損傷相互作用，導(dǎo)致以TNF-α 和IL-6 為代表的炎性因子異常釋放，進一步引起平滑肌細胞異常表達及遷移增生，加重動脈硬化閉塞癥的癥狀[11-12]，巨噬細胞內(nèi)的氧化型LDL 堆積，還可以誘發(fā)ET-1 大量釋放，加速疾病進程[13]。腦脈利顆粒組可以有效降低血清中TC、TG 和LDL 含量，升高血清中HDL 含量，并降低血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 炎癥因子水平，提示腦脈利顆粒通過減少動脈血管中的脂質(zhì)沉積、抑制炎癥反應(yīng)，減緩動脈硬化閉塞癥的發(fā)展進程。腦脈利顆粒組還可以有效升高血清中NO 和VEGF 含量，降低血清中ET-1 含量。提示腦脈利顆粒組通過對NO、ET-1 和VEGF 含量的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗自由基和促進血管新生的作用，進而改善血管內(nèi)皮功能紊亂的情況。臨床上NO、ET-1 的水平對于預(yù)測血管再狹窄的發(fā)生及判斷預(yù)后具有重要價值[14-15]。

《下肢動脈硬化閉塞癥診治指南》[7]指出，西洛他唑為治療間歇性跛行的一線藥物，實驗結(jié)果表明，腦脈利顆粒高劑量組升高血流速度，改善下肢動脈狹窄，降低血清中TC、TG、LDL、TNF-α、IL-1β、IL-6 和ET-1 的含量，升高血清中HDL、NO 和VEGF 水平的藥效作用與西洛他唑基本相當或略優(yōu)，說明其對下肢動脈硬化閉塞癥的治療具有積極的作用。

4 結(jié)論

通過大鼠高脂喂養(yǎng)加內(nèi)膜損傷模型首次驗證了腦脈利顆粒改善動脈硬化閉塞癥的作用，各劑量組的腦脈利顆粒通過改善下肢動脈狹窄、升高血流速度、調(diào)節(jié)血脂、抑制炎性反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能紊亂，發(fā)揮治療大鼠下肢動脈硬化閉塞癥的作用，且具有一定的劑量依賴關(guān)系。但由于人體ASO 病變過程較為復(fù)雜，后期尚需進一步探索，為可能開展的臨床研究提供實驗基礎(chǔ)，也為有效開發(fā)腦脈利顆粒的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。