酸棗仁皂苷A 促進阿爾茨海默病神經(jīng)干細胞模型增殖和分化作用的研究

陳吉聰，鄧 艷，肖洪賀，李婉嫕，李 妍，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性記憶力減退和認知功能障礙為主要表現(xiàn)[1]，其典型的病理特征為大腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失。由于缺乏有效的治療藥物，AD 已成為嚴重威脅人類晚年健康的主要疾病之一[2]。目前國內(nèi)外現(xiàn)有藥物雖能部分緩解AD 癥狀，但都無法修復腦內(nèi)大量丟失的神經(jīng)元，且存在一定的不良反應[3]。因此，尋找并建立能促進腦內(nèi)神經(jīng)再生、補充替代缺失神經(jīng)元的新方法對治療AD 具有重要意義。

神經(jīng)干細胞（Neural stem cells，NSCs）是存在于神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新和多向分化潛能的一類細胞，在特定條件下能分化成神經(jīng)系統(tǒng)的各類細胞，再生替代缺損的神經(jīng)組織，重建神經(jīng)功能。NSCs 的增殖、分化與遷移等行為高度依賴其生長的微環(huán)境，即神經(jīng)干細胞巢。AD 腦內(nèi)的病理損傷改變了神經(jīng)干細胞巢，妨礙了NSCs 生物學功能的發(fā)揮，使基于原位激活內(nèi)源性NSCs 的神經(jīng)發(fā)生和基于外源性NSCs移植的治療策略，都無法實現(xiàn)有效神經(jīng)再生[4]。

酸棗仁皂苷A（JuA）是中藥酸棗仁的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學研究表明，JuA 除具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用外[5]，還能夠抑制小膠質(zhì)細胞活化引起的炎癥反應，增強AD 模型小鼠學習記憶能力[6-7]。雖然JuA 的抗AD 作用逐漸受到關(guān)注，但尚無其促進神經(jīng)再生的有關(guān)報道。因此，本研究通過構(gòu)建APP-NSCs 細胞模型，進一步探究JuA 對APPNSCs 增殖與分化的影響，為其用于治療AD 提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 酸棗仁皂苷A（批號：wkq19090304，四川省維克奇生物科技有限公司）；胎牛血清（批號：19110505，浙江天杭生物科技股份有限公司）；青-鏈雙抗（批號：J190007，美國Hyclone 公司）；B27（批號：175040010，美國Gibco 公司）；質(zhì)粒提試劑盒（美國Omega 公司）；EGF、bFGF8 均購于美國PeproTech 公司；Nestin、SOX2、GFAP、NF-M、NG2 一抗均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠CyTM 3 標記二抗、驢抗小鼠FITC 標記二抗均購于美國Jackson 公司；CCK8、LDH試劑盒均購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 Ti-S 型倒置熒光顯微鏡（日本尼康株式會社）；C00I01HW 型CO2培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；MR-96A 型酶標儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；MG96G 型PCR 儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；SH-510 型凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.1.3 實驗動物 SPF 級C57BL/6 健康小鼠購于遼寧長生生物有限公司，合格證號：SCXK（遼）:2013-0001。研究中所有實驗動物相關(guān)操作都經(jīng)過遼寧中醫(yī)藥大學動物倫理審查委員會批準并嚴格按照國際實驗室倫理行為準則實施。

1.2 實驗方法

1.2.1 NSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定 從乳鼠海馬組織中分離NSCs，以5×106個/mL 的密度置于加入增殖培養(yǎng)基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、2%B27、1% P/S 的DMEM-F12）的24 孔板中培養(yǎng)。3 d半量換液，10 d 左右開始傳代。免疫熒光化學法檢測NSCs 標志性蛋白Nestin 和Sox2 表達。

1.2.2 APP-NSCs 模型的構(gòu)建 APP-NSCs 模型按本實驗室前期已報道的方法建立[8]，取GFP 或GFPAPP 質(zhì)粒15 μg、pLP1 質(zhì)粒6.5 μg、pLP2 質(zhì)粒2.5 μg、pLP/VSV-G 質(zhì)粒3.5 μg，采用脂質(zhì)體2000 介導轉(zhuǎn)染293T 細胞，空白對照組轉(zhuǎn)染GFP 質(zhì)粒。培養(yǎng)24 h 后，熒光顯微鏡下觀察，呈綠色熒光，收集病毒液并轉(zhuǎn)染NSCs。72 h 后采用RT-PCR 法和Western blot 檢測APP mRNA 以及蛋白的表達。

1.2.3 JuA 最佳藥物濃度的篩選 取P3 代APPNSCs 以5×104個/孔的密度鋪96 孔板，分別添加6.25、12.5、25、50、100 μmol/L JuA 培養(yǎng)，以正常培養(yǎng)的APP-NSCs 為對照，48 h 后每孔加入10 μL CCK8 試劑，37 ℃避光孵育1 h，最后使用酶標儀檢測A450值并計算細胞增殖率。檢測LDH 時，鋪板、分組、給藥培養(yǎng)同上，48 h 后取每孔的培養(yǎng)上清液按說明書操作，最后檢測A450值并計算LDH 釋放量。

1.2.4 JuA 對APP-NSCs 增殖能力的影響 實驗共分4 組，分別為NSCs 組、NSCs-JuA 組、APPNSCs 組、APP-NSCs-JuA 組。取NSCs、APP-NSCs按上述分組以1×106個/mL 的密度鋪24 孔板并置于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d 后鏡下隨機視野拍照，每組5 張，根據(jù)標尺計算神經(jīng)球直徑。另取NSCs、APPNSCs 按上述分組以5×106個/孔的密度鋪96 孔板，于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48 h 后每孔添加終濃度為20 μmol/L 的BrdU，12 h 后棄去，PBS 清洗，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗，隨后使用0.1%Triton×100 處理15 min，PBS 清洗后用2 mol/L HCl置于37 ℃下處理30 min，接著用0.1 mol/L，pH = 8.5的硼酸緩沖液中和10 min，PBS 清洗，使用5% BSA室溫封閉30 min，棄去液體，孵育一抗，4℃過夜。棄去液體，PBS 清洗，加入二抗，室溫孵育1h，PBS 清洗，DAPI 室溫染核5 min，最后鏡下隨機視野拍照，每組5 張。

1.2.5 JuA 對APP-NSCs 分化能力的影響 按“1.2.4”項下分組將NSCs、APP-NSCs 以1×106個/mL的密度鋪24 孔板，置于分化培養(yǎng)基（含10% FBS、1% P/S 的DMEM-F12）中培養(yǎng)，10 d 后使用免疫熒光化學法檢測各組向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞分化率。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSCs 的鑒定與APP-NSCs 模型的構(gòu)建

NSCs 的鑒定結(jié)果見圖1，通過免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)NSCs 表達Nestin 和Sox2 雙陽性，證明分離提取的細胞為未分化的NSCs。APP-NSCs 的構(gòu)建過程見圖2。鏡下可見APP-NSCs 表達GFP 綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功，見圖3。Western blot 及RT-PCR 結(jié)果見圖4，與GFP-NSCs 組相比，APP-NSCs 組的Aβ1-42蛋白及APP mRNA 的表達量上升，結(jié)果證明APP-NSCs 模型制備成功。

圖1 NSCs 的鑒定Fig. 1 Identification of NSCs

圖2 APP-NSCs 的構(gòu)建Fig. 2 Construction of APP-NSCs

圖3 APP-NSCs 的鑒定Fig. 3 Identification of APP-NSCs

圖4 Western blot 條帶圖與RT-PCR 條帶圖Fig. 4 Western blot strip plot and RT-PCR strip plot

2.2 JuA對APP-NSCs細胞活性和LDH釋放量的影響

與對照組相比，25、50、100 μmol/L JuA 組的細胞增殖率上升（P＜0.05），LDH 釋放量下降（P＜0.05）。 結(jié)果表明，25、50、100 μmol/L JuA 均對APP-NSCs 具有一定的保護作用，根據(jù)實驗結(jié)果，選擇25 μmol/L 作為后續(xù)實驗給藥劑量，見圖5。

圖5 JuA 對APP-NSCs 細胞增殖率和LDH 釋放量的影響（n = 6）Fig. 5 Effects of JuA on cellular activity and LDH release from APP-NSCs（n = 6）

2.3 JuA 對APP-NSCs 增殖能力的影響

與NSCs 組相比，NSCs-JuA 組神經(jīng)球直徑增大（P＜0.05），APP-NSCs 組神經(jīng)球直徑減?。≒＜0.01）；與APP-NSCs 組相比，APP-NSCs-JuA 組神經(jīng)球直徑增大（P＜0.01），見圖6、圖7。

圖6 JuA 對神經(jīng)球直徑的影響Fig. 6 Effects of JuA on the neurosphere diameter

圖7 JuA 對神經(jīng)球直徑影響的統(tǒng)計圖（n = 5）Fig. 7 Statistical plot of the effects of JuA on neurosphere diameter （n = 5）

與NSCs 組相比，NSCs-JuA 組的BrdU+陽性率上升（P＜0.05），APP-NSCs 組的BrdU+陽性率降低（P＜0.01）；而相較于APP-NSCs 組，APP-NSCs-JuA 組BrdU+陽性率上升（P＜0.01），BrdU+結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 JuA 對BrdU+陽性率的影響Fig. 8 Effects of JuA on the percentage of BrdU+

圖9 JuA 對BrdU+陽性影響的統(tǒng)計圖（n = 5）Fig. 9 Statistical plot of the effects of JuA on the percentage of BrdU+（n = 5）

2.4 JuA 對APP-NSCs 分化能力的影響

與NSCs 組相比，NSCs-JuA 組向神經(jīng)元（NFM）分化的比率上升 （P＜0.05），向星形膠質(zhì)細胞（GFAP）分化的比率下降（P＜0.05），APP-NSCs組向神經(jīng)元分化的比率降低（P＜0.01），向星形膠質(zhì)細胞分化的比率上升（P＜0.01）；而APP-NSCs經(jīng)過JuA 治療后，與APP-NSCs 組相比，向神經(jīng)元分化的比率上升（P＜0.05），向星形膠質(zhì)細胞分化的比率下降（P＜0.01），結(jié)果見圖10、圖11。

圖10 JuA 對分化的影響Fig. 10 Effects of JuA on the differentiation

圖11 JuA 對分化影響的統(tǒng)計圖（n = 5）Fig. 11 Statistical plot of the effects of JuA on the differentiation（n = 5）

3 討論

由于目前AD 的發(fā)病機制尚未完全闡述清楚，使得AD 體外細胞模型的構(gòu)建呈現(xiàn)多樣性。通常采用β-淀粉樣蛋白、谷氨酸、過氧化氫、岡田酸等誘導SH-SY5Y 和PC12 細胞建立AD 細胞模型，揭示AD細胞凋亡、炎性反應、氧化應激損傷、Tau 蛋白磷酸化等機制[9]。而本研究采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，即采用APP595/596 基因轉(zhuǎn)染NSCs 的方法構(gòu)建AD 細胞模型，其優(yōu)勢在于可以持續(xù)穩(wěn)定的表達Aβ，更好地模擬了腦內(nèi)的微環(huán)境，一定程度上提高了病理表達的準確性。通過Western Blot 及RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后NSCs，發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)高表達APP 基因和致病Aβ1-42蛋白，由此證明APP-NSCs 模型構(gòu)建成功。

NSCs 的增殖和分化對于維持大腦正常的認知和情感功能至關(guān)重要，但是隨著年齡的增長大腦中神經(jīng)再生逐漸衰減，而AD 患者腦內(nèi)神經(jīng)再生明顯低于同齡水平，激活神經(jīng)再生為AD 的治療提供了新的策略。文獻報道顯示JuA 能有效抑制脂多糖誘導的BV-2 小膠質(zhì)細胞的炎癥反應[6]，還可改善Aβ42誘導的小鼠認知功能障礙和腦組織損傷[9]，說明JuA 具有良好的神經(jīng)保護作用。本實驗結(jié)果證實，JuA 能提升APP-NSCs 的存活率并降低其LDH 的釋放量，并恢復APP-NSCs 的增殖能力和向神經(jīng)元分化的能力，說明JuA 能夠減輕過表達APP 引起的NSCs 增殖和分化功能損傷，有望改善AD 癥狀，但JuA 能否激活AD 模型小鼠海馬神經(jīng)再生以及具體機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究以APP-NSCs 為體外細胞模型，從細胞增殖、分化方面探討JuA 對AD 細胞模型的影響，研究證實JuA 可提高APP-NSCs 的增殖能力，并促進其向神經(jīng)元分化。但作為體外實驗，本實驗結(jié)果可能具有一定的局限性，JuA 促進神經(jīng)再生的作用有待通過動物模型進一步驗證。本實驗從神經(jīng)再生角度出發(fā)，為JuA 用于AD 的潛在應用提供了實驗基礎(chǔ)。