高良姜PAL 基因的序列和表達模式分析

黃瓊林

（廣東醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023）

中藥高良姜來源于姜科多年生草本植物高良姜Alpinia officinarumHance 的干燥根莖[1]，是我國傳統(tǒng)藥食兩用大宗藥材。高良姜具有溫胃止嘔、散寒止痛等功效，可用于治療脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等癥。 資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高良姜野生資源已經(jīng)基本滅絕，人工栽培高良姜也在逐年明顯下降，不少地區(qū)已出現(xiàn)高良姜藥材供不應(yīng)求的態(tài)勢，不能滿足臨床和民俗需要[2-3]。

黃酮是高良姜的主要成分和藥效物質(zhì)之一。高良姜含有高良姜素、高良姜酚、山柰素、山柰酚、槲皮素和異鼠李素等黃酮類化合物，這些化合物具有抗氧化、降尿酸、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌等藥理活性[4-5]。鑒于高良姜的藥理活性成分比較清楚，通過基因工程調(diào)控黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶基因表達，促進高良姜藥效成分的合成和提高高良姜藥用質(zhì)量，是緩解高良姜當前資源不足的方法之一。

苯丙烷代謝途徑是黃酮類化合物生物合成的上游途徑，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）則是該途徑的第一個關(guān)鍵限速酶，催化L-苯丙氨酸產(chǎn)生反式肉桂酸，再經(jīng)香豆酸、芥子酸等中間產(chǎn)物及相應(yīng)的催化酶的作用下，分別生成黃酮、木質(zhì)素和酚類等代謝產(chǎn)物[6]。此外，PAL 也是植物初級代謝和次生代謝的關(guān)鍵連接點，對植物生長發(fā)育、花色形成、抗病抗逆等生理過程具有重要的調(diào)控作用[7]。目前，PAL基因已從膜莢黃芪[8]、華細辛[9]、枸杞[10]等中藥材中獲得克隆，而高良姜的黃酮生物合成相關(guān)酶基因研究的報道仍較少。

本研究擬基于高良姜轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘高良姜PAL基因cDNA 序列，探討其序列特征以及在高良姜不同組織中的表達差異，為今后高良姜PAL基因的功能鑒定和表達調(diào)控建立研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因序列

在前期研究中，作者以產(chǎn)自道地產(chǎn)區(qū)——廣東省徐聞縣的高良姜為材料，采用因美納NovaSeq 6000 平臺進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，并通過序列組裝獲得147 652 條非重復(fù)序列基因[11]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過序列比對檢索和注釋高良姜PAL基因并確定其序列。

1.2 主要試劑

RNA prep Pure Plant Kit 試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；GoScript Reverse Transcription System 和GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒均購自美國普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因序列分析

采用Omiga 2.0 對高良姜PAL基因序列進行編碼區(qū)及開放閱讀框（Open reading frame，ORF）檢索，并將其翻譯成蛋白質(zhì)序列。利用Protparam 和Protscale 軟件分析基因序列的組成和親/疏水性等理化特征。使用Conserved Domains 數(shù)據(jù)庫分析編碼蛋白質(zhì)的保守功能域，利用Target 1.1 和TMHMM 軟件完成編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運肽、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析。采用SOPMA 軟件分析編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。運用ClustalX 和MEGA 軟件完成編碼蛋白質(zhì)的多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 基因表達分析

采用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測高良姜PAL基因在不同組織樣品中的表達差異。分別以新鮮高良姜的根莖、莖和葉為材料，使用RNA prep Pure Plant Kit 提取總RNA，再用GoScript Reverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)檢索所得的高良姜PAL基因序列，設(shè)計用于qPCR 的特異性引物，其中，上游引物的序列為：5'-CTTCAGGGCTACTCAGGCAT-3'；下游引物序列為：5'-GTAGGACAGGGGAACGAGG-3'。 參照GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒的說明書，qPCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中，2 × qPCR Master Mix 10 μL，10 μM 上、下游引物各0.3 μL，cDNA 模板適量，并用滅菌蒸餾水補足體積。qPCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環(huán)。以β-tubulin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計算高良姜PAL基因的相對表達量。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因序列檢索

通過在高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢索，獲得一條注釋為PAL基因的cDNA 序列，并將其命名為AoPAL。AoPAL序列長度為2 261 bp，其中含有2 130 bp編碼區(qū)、44 bp 5'端非編碼區(qū)和84 bp 3'端非編碼區(qū)。AoPAL編碼區(qū)包含2 130 個堿基，GC 含量為64.2%，編碼710 個氨基酸，見圖1。

圖1 AoPAL 基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and encoded amino acid sequence of AoPAL coding region

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

AoPAL等15 個植物來源的PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，見圖2，15 個PAL基因聚類成兩大分支，其中，AoPAL與單子葉植物小果野芭蕉、玉米和鐵皮石斛等來源的PAL基因聚集為一支，而其它雙子葉植物來源的PAL基因聚成另外一支，這些PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育聚類結(jié)果與對應(yīng)植物起源分類相符。AoPAL與源于單子葉植物的PAL基因具有較高的序列同源性和保守度，推測它們在功能上也有較高的相似性。

圖2 15 個植物來源PAL 基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系聚類圖Fig. 2 Phylogenetic tree of PAL genes from 15 plants

2.3 編碼蛋白的功能分析

為了更好地理解AoPAL的功能，對AoPAL的編碼蛋白進行保守功能域分析。將AoPAL編碼蛋白的氨基酸序列導(dǎo)入Conserved Domains 數(shù)據(jù)庫，保守功能域檢索結(jié)果，見圖3，編碼蛋白AoPAL 具有多位活性位點，包含1 個從第8 位氨基酸到第710 位氨基酸的苯丙氨解氨酶的保守功能域，歸屬于苯丙氨解氨酶超級家族。結(jié)果表明，AoPAL 具有苯丙氨解氨酶的功能，而AoPAL即為高良姜苯丙氨解氨酶的編碼基因。

圖3 AoPAL 蛋白保守功能域示意圖Fig. 3 Conserved domains of AoPAL

2.4 編碼蛋白的特征分析

編碼蛋白AoPAL 的分子量76.55 kDa，等電點為5.78，包含丙氨酸、亮氨酸等20 余種氨基酸。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為37.29，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。AoPAL 多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性，沒有出現(xiàn)明顯的疏水區(qū)域，說明其屬于水溶性蛋白質(zhì)。

TMHMM 分析顯示，AoPAL 整條多肽鏈均位于細胞膜外，不含任何跨膜結(jié)構(gòu)域，說明AoPAL 在細胞質(zhì)中發(fā)揮功能。亞定位分析也發(fā)現(xiàn)，AoPAL 不含有信號肽和轉(zhuǎn)運肽，進一步表明了AoPAL 在細胞質(zhì)中合成并執(zhí)行相應(yīng)的催化功能。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析顯示，AoPAL 由407 個α-螺旋、64 個延伸鏈、44 個β-轉(zhuǎn)角和199 個隨意卷曲組成，表明其為以α-螺旋和隨意卷曲為主要元件構(gòu)成的混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)。

2.5 基因表達分析

基于熒光定量PCR 計算的相對表達量，見圖4，AoPAL在根莖、莖中的表達水平顯著高于葉，其中，又以在根莖中的表達水平最高。

圖4 AoPAL 在高良姜不同組織的中表達分析Tab. 4 Expression difference of AoPAL in various tissue of A. officinarum

3 討論

PAL 在黃酮類、木質(zhì)素以及其它活性成分的生物合成有著重要的作用，其表達與黃酮的積累密切相關(guān)[12]。關(guān)巍等[13]發(fā)現(xiàn)PAL 活性在彩色馬鈴薯發(fā)育期間與花色苷的積累呈現(xiàn)正相關(guān)性。郭肖等[14]研究表明水芹黃酮含量與PAL 活性的變化趨勢一致，且二者相關(guān)系數(shù)極為顯著。因此，調(diào)控PAL 的表達和活性可以有效地提高黃酮類化合物的合成。

轉(zhuǎn)錄組測序能以高通量模式挖掘無基因組參考物種的基因序列，是基因組圖譜仍屬空白的大多藥用植物進行功能基因鑒定、活性成分的生物合成和調(diào)控機理研究的有效方法之一[15]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組高通量測序獲取AoPAL的cDNA 全長和編碼區(qū)序列，相比同源克隆和 RACE 技術(shù)等傳統(tǒng)的基因挖掘方法，具有簡單、方便和高效等顯著優(yōu)勢。生物信息學(xué)分析表明，AoPAL 氨基酸序列與已報道的植物PAL 氨基酸序列同源性較高，二級結(jié)構(gòu)也與青天葵等單子葉植物相似，均是以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。AoPAL 同樣包含PAL-HAL 結(jié)構(gòu)域，并歸屬苯丙氨酸解氨酶超級家族，因此說明AoPAL 是具有苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白質(zhì)。

植物PAL基因多以基因家族形式存在，不同植物中常含有2 ～ 6 個PAL基因家族成員，這些成員在不同組織中的表達模式以及在植物次生代謝產(chǎn)物的合成和調(diào)控過程所發(fā)揮的作用也各有不同[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，AoPAL在高良姜的根莖中表達高于葉和莖兩個地上部位，這與高良姜根莖部位藥效成分含量較高并以根莖入藥的事實相符。然而，AoPAL在高良姜黃酮類生物合成上涉及的具體通路和作用還有待進一步探討。

4 結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序挖掘到高良姜次生代謝苯丙烷代謝途徑的第一步關(guān)鍵限速酶基因AoPAL，明確了該基因的序列特征及其編碼蛋白的功能，并探討了其在高良姜不同組織中的表達模式，為高良姜黃酮類藥效成分的生物合成和基因調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。