半枝蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的研究

許靜遠(yuǎn)，黃冬婷，孫含章，李賢慧，孔 穎，姜 波，秦民堅(jiān)

(1. 常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215000； 2. 中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

半枝蓮Scutellaria barbataD.Don 為唇形科黃芩屬多年生草本植物，以干燥全草入藥，具有清熱解毒、化瘀利尿等功效，臨床應(yīng)用廣泛[1]。雖然半枝蓮多用種子進(jìn)行人工栽培，但目前針對(duì)半枝蓮的研究還主要集中在化學(xué)成分分離、藥理作用以及栽培技術(shù)等方面，有關(guān)種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的研究尚未見報(bào)道，不利于半枝蓮種子生產(chǎn)銷售過程中的質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)。中藥材種子是中藥材人工繁育的基礎(chǔ)，是從源頭保證中藥材品質(zhì)優(yōu)良、質(zhì)量可控的關(guān)鍵[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)半枝蓮種子的質(zhì)量檢驗(yàn)方法進(jìn)行研究，以期為制定科學(xué)合理的半枝蓮種子檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以2020 年7 月間在河南省確山縣收集的半枝蓮種子作為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)中國藥科大學(xué)秦民堅(jiān)教授鑒定為唇形科植物半枝蓮S. barbata的種子。

1.2 主要試劑

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC，BR 級(jí)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）； 溴麝香草酚蘭［BTB，BS級(jí)，生工生物工程（上海）股份有限公司］

1.3 主要儀器及設(shè)備

DHG-9079A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）； GZX-250BSH-III 型光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）； PR124ZH 型萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）； 雷磁DDS-307A 型電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

2 方法

2.1 扦樣

參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 扦樣（GB/T 3543.2-1995）》中的方法[3]，采用徒手四分法分取初次樣品和實(shí)驗(yàn)樣品。根據(jù)“凈度分析”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)樣品應(yīng)不少于2 500 粒種子及送檢樣品為實(shí)驗(yàn)樣品10 倍量確定半枝蓮種子送檢樣品及凈度分析試樣的最小質(zhì)量。

2.2 凈度分析

在保證實(shí)驗(yàn)樣品中半枝蓮種子不少于2 500 粒的情況下，選取一定量的實(shí)驗(yàn)樣品，按照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 凈度分析（GB/T 3543.3-1995）》方法[4]，隨機(jī)分取三份規(guī)定重量的試樣，在不損傷種子的基礎(chǔ)上，對(duì)試樣進(jìn)行挑選，分開凈種子、其它種子和雜質(zhì)并分別稱重記錄，計(jì)算種子凈度，稱重至小數(shù)位四位，公式如下：

2.3 種子真實(shí)性鑒定

從凈種子中隨機(jī)選取100 粒種子作為一個(gè)重復(fù)，設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。采用形態(tài)鑒定法對(duì)半枝蓮種子的形態(tài)、大小、顏色及表面特征進(jìn)行觀察記錄，并作為半枝蓮種子鑒定的依據(jù)。

2.4 種子重量測定

取凈選后的半枝蓮種子，參考《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 其他項(xiàng)目（GB/T 3543.7-1995）》[5]，分別采用百粒法（8 組重復(fù)）、五百粒法 （4 組重復(fù)）以及千粒法（4 組重復(fù)）估算種子千粒重，并計(jì)算各組間的變異系數(shù)。

2.5 種子含水量測定

取凈選后的半枝蓮種子，參考《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 水分測定（GB/T 3543.6-1995）》[6]，分別考察高溫恒溫烘干法（131 ± 1）℃和低溫恒溫烘干法（103 ± 1）℃，以確定半枝蓮種子含水量的測定方法。上述實(shí)驗(yàn)每次稱量種子（1.00 ± 0.03）g，每種烘干方法設(shè)置6 次重復(fù)。

2.6 種子發(fā)芽率測定

2.6.1 種子密度對(duì)發(fā)芽率的影響 半枝蓮種子體積較小，浸泡一定時(shí)間后常出現(xiàn)部分種子浮于表面，部分種子沉于水底的情況，因此首先比較不同密度半枝蓮種子的萌發(fā)率差異。將半枝蓮種子在25 ℃、黑暗條件下進(jìn)行萌發(fā)，以雙層紗布為發(fā)芽床，保證發(fā)芽床濕潤且無多余水分。每種處理設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放置50 粒種子。比較不同密度半枝蓮種子的發(fā)芽率是否有差異。

2.6.2 光照對(duì)萌發(fā)率的影響 種子培養(yǎng)光照條件分別設(shè)置為：光照、黑暗以及光照/黑暗各12 h 交替三種不同光照條件，其余培養(yǎng)條件同“2.6.1”，比較不同光照條件對(duì)半枝蓮種子發(fā)芽率的影響。

2.6.3 浸種時(shí)長對(duì)萌發(fā)率的影響 用蒸餾水分別浸泡半枝蓮種子0、3、6、12、24 h，光照條件為光照/黑暗各12 h，其余培養(yǎng)條件同“2.6.1”，考察浸種時(shí)長對(duì)半枝蓮種子發(fā)芽率的影響。

2.6.4 適宜發(fā)芽床的確定 考察3 種不同的發(fā)芽床對(duì)半枝蓮種子萌發(fā)率的影響：（1）在培養(yǎng)皿中鋪一層濕濾紙，然后置種；（2）在培養(yǎng)皿中鋪雙層濕潤的紗布，然后置種；（3）在培養(yǎng)皿中放入過60 目篩的高溫滅菌細(xì)沙20 g，將種子壓入沙床表層，與沙床表面持平。其余培養(yǎng)條件同“2.6.3”，比較不同發(fā)芽床對(duì)半枝蓮種子發(fā)芽率的影響，以選取適宜的發(fā)芽床。

2.6.5 適宜發(fā)芽溫度的確定 考察不同溫度對(duì)半枝蓮種子萌發(fā)率的影響，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃恒溫以及20 ℃/25 ℃變溫，其余培養(yǎng)條件同“2.6.3”，比較不同溫度下半枝蓮種子的萌發(fā)率。

2.7 種子生活力測定

分別采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法[7]、電導(dǎo)率測定法[8]以及溴麝香草酚蘭（BTB）法[9]測定半枝蓮種子的生活力，探討半枝蓮種子活力測定的最佳方法。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

根據(jù)半枝蓮種子千粒重結(jié)果和扦樣原則，確定送檢的半枝蓮種子樣品最少為8.0 g，凈度分析試樣最少為0.8 g。

3.2 凈度分析

大多數(shù)市售的半枝蓮種子在采收后未經(jīng)過嚴(yán)格的除雜處理，常會(huì)夾雜泥土灰塵、其它的植物種子以及碎葉、碎石子等雜質(zhì)，因此在檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)對(duì)半枝蓮種子進(jìn)行凈度分析。由于種子上附帶的灰塵泥土量少，同時(shí)在樣品處理及轉(zhuǎn)移過程中會(huì)有損失，因此不納入種子凈度分析范圍。凈度分析的結(jié)果表明：半枝蓮種子的凈度為（78.44 ± 0.74）%，種子凈度較高；樣品中碎葉、碎石子等雜質(zhì)所占比例為（18.85 ± 0.55） %，為市售半枝蓮種子中的主要雜質(zhì)；其它植物的種子所占比例為（1.30 ± 0.82）%，所占比例較低。

3.3 真實(shí)性鑒定

半枝蓮種子呈不規(guī)則卵圓形，一端略尖，一端鈍圓，種皮顏色為墨綠色至褐色，種皮表面不平整，密被凸起，見圖1。整個(gè)種子粒長0.87 ～ 1.85 mm，粒寬0.69 ～ 1.02 mm。

圖1 半枝蓮種子外觀形態(tài)特征Fig. 1 The morphological of S. barbata seeds

3.4 重量測定

采用百粒法測定半枝蓮種子千粒重時(shí)組內(nèi)變異系數(shù)最大，而千粒法測定半枝蓮種子千粒重時(shí)變異系數(shù)最小，因此測定半枝蓮種子千粒重時(shí)宜采用千粒法，見表1。

表1 半枝蓮種子重量測定Tab. 1 The determination of seed weight of S. barbata

3.5 含水量測定

采用高溫烘干法測定半枝蓮種子含水量時(shí)，5 個(gè)不同烘干時(shí)長下所測得種子含水量結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），說明采用高溫烘干法時(shí)半枝蓮種子在1 h 以內(nèi)迅速失去水分。采用低溫烘干法測定含水量時(shí)，烘干0.5、1 、1.5 h 所測得種子含水量均小于烘干2 h的結(jié)果，隨著烘干時(shí)長進(jìn)一步增加，烘干2.5 h 之后，所測得結(jié)果與烘干2 h 結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。此外，對(duì)兩種不同烘干方法在相同烘干時(shí)長下的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明5 個(gè)不同烘干時(shí)長下高溫烘干法所測得的半枝蓮種子含水量均大于低溫烘干法所得結(jié)果（P＜ 0.05），說明低溫烘干法在較短時(shí)間內(nèi)不能將半枝蓮種子完全烘干，烘干效率較高溫法低。從能源節(jié)省和操作簡便性考慮，可選擇高溫烘干0.5 h 作為半枝蓮種子含水量的測定方法，見表2。

表2 不同烘干條件下半枝蓮種子含水量（±s, n = 6）Tab. 2 The water content of S. barbata seeds determined by different drying methods（±s, n = 6）

表2 不同烘干條件下半枝蓮種子含水量（±s, n = 6）Tab. 2 The water content of S. barbata seeds determined by different drying methods（±s, n = 6）

注：同列不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），下表同。

烘干時(shí)長/h高溫烘干法/ %低溫烘干法/ %tP 0.59.13 ± 0.538.03 ± 0.07a5.1100.001 1 9.67 ± 0.548.19 ± 0.06b6.6250.000 1.59.78 ± 0.568.30 ± 0.10b6.3980.000 2 9.80 ± 0.558.49 ± 0.07c5.8010.000 2.59.85 ± 0.568.56 ± 0.10c5.5120.000 F 1.40245.750 P 0.242 0.000

3.6 種子萌發(fā)率測定

3.6.1 種子密度對(duì)萌發(fā)率的影響 不同密度的半枝蓮種子培養(yǎng)前6 d 萌發(fā)率均明顯提高，之后萌發(fā)率無明顯變化；在相同條件下培養(yǎng)14 d 后密度較小的上層種子萌發(fā)率明顯高于密度較大的下層種子萌發(fā)率（P＜ 0.05），因此密度較小的半枝蓮種子萌發(fā)率更高，見圖2。

圖2 不同密度半枝蓮種子萌發(fā)率比較（n = 6）Fig. 2 The comparison of the germination rate of S. barbata seeds with different densities（n = 6）

3.6.2 光照對(duì)萌發(fā)率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明持續(xù)光照、持續(xù)黑暗以及光照/黑暗各12 h 交替三種不同條件下半枝蓮種子萌發(fā)率分別為（92.67 ± 4.13）%、（91.67 ± 1.51）%和（89.33 ± 4.32）%，三種不同光照條件下種子萌發(fā)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由于黑暗條件下半枝蓮種子萌發(fā)后子葉較小，顏色為黃白色，不利于萌發(fā)初期的觀察統(tǒng)計(jì)，因此半枝蓮種子萌發(fā)時(shí)的光照條件設(shè)置為光照/黑暗各12 h交替。

3.6.3 浸種時(shí)長對(duì)萌發(fā)率的影響 不同浸種時(shí)長下半枝蓮種子的萌發(fā)率結(jié)果見表3，提前浸泡0、3、6 以及12 h 的半枝蓮種子萌發(fā)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；而當(dāng)浸種時(shí)間延長至24 h 時(shí)，半枝蓮種子的萌發(fā)率降低，其萌發(fā)率明顯低于其余四組（P＜ 0.05），說明半枝蓮種子進(jìn)行萌發(fā)檢驗(yàn)前無需提前浸種。

表3 不同浸種時(shí)長下半枝蓮種子的萌發(fā)率（±s, n = 6）Tab.3 The germination rate of S. barbata seeds with different pre-soaking time（±s, n = 6）

表3 不同浸種時(shí)長下半枝蓮種子的萌發(fā)率（±s, n = 6）Tab.3 The germination rate of S. barbata seeds with different pre-soaking time（±s, n = 6）

浸種時(shí)長 / h萌發(fā)率 / %0 42.67 ± 6.65a 43.67 ± 7.53a 6 38.33 ± 10.54a 3 1239.67 ± 2.66a 2426.67 ± 6.02b F 5.435 P 0.003

3.6.4 適宜發(fā)芽床的確定 半枝蓮種子在濾紙、紗布和河沙上的萌發(fā)率分別為（35.67 ± 8.24）%、（36.66 ± 4.13）%和（27.66 ± 2.66）%。半枝蓮種子在濾紙和紗布上的萌發(fā)情況一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；而半枝蓮種子在沙子發(fā)芽床上的萌發(fā)率明顯低于使用其它兩種萌發(fā)床時(shí)的發(fā)芽率（P＜0.05）。由于半枝蓮種子體積較小，相較于濾紙發(fā)芽床，紗布更容易固定種子，且鎖水性較好，考慮試驗(yàn)操作和觀察統(tǒng)計(jì)的簡便性，可選紗布床作為半枝蓮種子萌發(fā)檢驗(yàn)時(shí)的發(fā)芽床。

3.6.5 適宜發(fā)芽溫度的確定 不同培養(yǎng)溫度下半枝蓮種子的萌發(fā)率，見表4。半枝蓮種子的萌發(fā)率在25 ℃恒溫、30 ℃恒溫以及20/25 ℃變溫三種不同培養(yǎng)溫度下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），而半枝蓮種子在15 ℃和20 ℃條件下的萌發(fā)率明顯低于其它三種溫度下的萌發(fā)率（P＜ 0.05）?？紤]檢驗(yàn)操作的簡便性以及對(duì)培養(yǎng)設(shè)備的要求，選擇25 ℃恒溫作為半枝蓮種子萌發(fā)檢驗(yàn)時(shí)的培養(yǎng)溫度。

表4 不同溫度下半枝蓮種子的萌發(fā)率（±s, n = 6）Tab. 4 The germination rate of S. barbata seeds at different germination temperature（±s, n = 6）

表4 不同溫度下半枝蓮種子的萌發(fā)率（±s, n = 6）Tab. 4 The germination rate of S. barbata seeds at different germination temperature（±s, n = 6）

培養(yǎng)溫度 / ℃萌發(fā)率 / %1511.00 ± 2.75a 2023.33 ± 2.73b 2535.67 ± 4.46c 3032.67 ± 3.50c 20/2540.00 ± 9.03c F 31.090 P 0.000

3.7 種子生活力測定

本研究首先選取應(yīng)用最廣泛的TTC 染色法測定半枝蓮種子的生活力，結(jié)果見表5。半枝蓮種子在1%濃度的TTC 溶液中浸泡12 h 和24 h 后的染色率明顯低于浸泡48 h 和72 h 后的染色率（P＜ 0.05），而浸泡48 h 的染色結(jié)果與浸泡72 h 的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。上述結(jié)果表明具有生活力的半枝蓮種子在1%濃度的TTC 溶液中浸泡48 h 后已基本被染色，可記錄染色情況，估算種子生活力。

表5 TTC 法測定半枝蓮種子活力（±s, n = 3）Tab.5 The seed vigor of S. barbata seeds determined by TTC method（±s, n = 3）

表5 TTC 法測定半枝蓮種子活力（±s, n = 3）Tab.5 The seed vigor of S. barbata seeds determined by TTC method（±s, n = 3）

染色時(shí)長 / h染色率 / %12 3.33 ± 2.31a 2438.00 ± 2.00b 4844.00 ± 4.00c 7245.33 ± 3.05c F 135.897 P 0.000

本研究進(jìn)一步考察了BTB 法和電導(dǎo)率法在半枝蓮種子生活力檢測中的適用性。半枝蓮種子在BTB培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3 d 均無黃色光圈，說明BTB 法不適于測定半枝蓮種子活力。采用電導(dǎo)率法測定半枝蓮種子活力，所得半枝蓮種子相對(duì)電導(dǎo)率為（52.23 ±2.51）%，與TTC 染色法所得結(jié)果較接近。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性以及可操作性，宜采用電導(dǎo)率法進(jìn)行半枝蓮種子生活力測定。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定半枝蓮種子的質(zhì)量檢驗(yàn)方法，見表6。

表6 半枝蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法Tab. 6 Testing methods for seed quality of S. barbata

4 討論

種子活力是決定種子和種子批在發(fā)芽和出苗期的活性強(qiáng)度和種子特征的表現(xiàn)，種子活力直接影響種子出苗速度以及長成幼苗的潛力[10]。TTC 法是一種結(jié)果可靠的測定種子生活力的方法，目前已用于多種中藥種子的生活力檢驗(yàn)[7,11]。然而采用TTC 法檢測種子活力時(shí)，需要逐一剝?nèi)シN皮，觀察記錄種子染色情況，不易于操作觀察體積較小的種子。電導(dǎo)率測定法也可用于檢測種子活力，具有簡便、可操作性強(qiáng)和時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[12]，如盧魏魏等[8]采用電導(dǎo)率法成功檢驗(yàn)了較為細(xì)小的白花蛇舌草種子的活力。本研究也考察比較了TTC 法和電導(dǎo)率法在半枝蓮種子活力檢測中的適用性。結(jié)果表明采用電導(dǎo)率法測得的半枝蓮種子生活力與TTC 染色法的結(jié)果較接近，但TTC 法耗時(shí)長且被染色的半枝蓮種子不易觀察，不利于統(tǒng)計(jì)。因此在測定半枝蓮種子活力時(shí)宜選用電導(dǎo)率法，有利于節(jié)省檢測時(shí)間，提高檢測效率。

此外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)采收初期的半枝蓮種子萌發(fā)率能夠達(dá)到80%以上，但由于整個(gè)研究周期較長，隨著種子貯藏時(shí)間增加，在研究后期半枝蓮種子的萌發(fā)率降低至50%。通常情況下，種子的萌發(fā)率會(huì)隨著貯藏時(shí)間的延長而逐漸降低。羅倩等[13]研究發(fā)現(xiàn)室溫貯藏的獨(dú)活種子萌發(fā)率會(huì)隨貯藏時(shí)間延長而顯著降低,在采收后第一年的7 月份降低為0。李青蓮[14]研究發(fā)現(xiàn)夏枯草種子的發(fā)芽率和生活力均隨貯藏時(shí)間的延長而降低。這說明貯藏時(shí)間可能會(huì)影響半枝蓮種子的生活力和萌發(fā)率，今后在開展半枝蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡可能地縮短整個(gè)檢驗(yàn)周期，以避免因檢驗(yàn)過程中種子貯存時(shí)間過長導(dǎo)致生活力下降，造成檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確；同時(shí)也提示我們應(yīng)進(jìn)一步開展對(duì)半枝蓮種子貯藏條件的相關(guān)研究，從而為半枝蓮種子的合理貯存提供技術(shù)支持。

5 結(jié)論

本研究通過測定扦樣、凈度、真實(shí)性、千粒重、含水量、種子萌發(fā)條件以及生活力等指標(biāo)建立了半枝蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，該法操作簡便、重復(fù)性好，為進(jìn)一步制定半枝蓮種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持。