利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生物信息學(xué)初步探討熱射病預(yù)后關(guān)鍵基因

張玲琴, 謝建剛, 王倩梅, 徐云云, 黃 楊

熱射病是自有記錄以來一直困擾人類的疾病。由于全球氣溫不斷升高，熱射病的發(fā)生率和病死率明顯增加，成為近年來廣受關(guān)注的社會(huì)公共衛(wèi)生突發(fā)事件[1]。熱射病發(fā)病急且進(jìn)展迅速，可導(dǎo)致多個(gè)器官發(fā)生系統(tǒng)性損傷，致死率、致殘率特別高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在夏季熱射病人群發(fā)病率為(17.6～26.5)/10萬，住院患者病死率為14%～65%，而入住ICU的熱射病患者病死率在60%以上[2]。熱射病主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、凝血障礙、肝腎功能衰竭、橫紋肌溶解等臨床現(xiàn)象[3]。目前臨床上主要采取快速降溫、糾正休克、改善凝血、腦保護(hù)及肝腎功能替代療法等手段進(jìn)行治療[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，熱射病患者即使接受同樣的治療也可能預(yù)后不同，因而明晰影響熱射病預(yù)后的要素，對(duì)熱射病治療可能有一定的指導(dǎo)意義。國內(nèi)目前對(duì)影響熱射病的相關(guān)研究主要集中在根據(jù)臨床結(jié)果與預(yù)后相關(guān)性分析[6]，國外有通過動(dòng)物模型、細(xì)胞測(cè)序探索熱射病發(fā)展的關(guān)鍵分子因素，提示免疫細(xì)胞分化及功能調(diào)控是主要原因[7]。本研究擬通過對(duì)不同預(yù)后熱射病患者發(fā)病早期外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMC)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，探究潛在的關(guān)鍵細(xì)胞通路和功能，篩選出影響熱射病預(yù)后的重要基因，為熱射病臨床研究和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019-06-01～2020-08-30空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院急診科救治的熱射病患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：按照中國熱射病診斷與治療專家共識(shí)[2]，診斷為熱射??；年齡18～60歲；入科時(shí)病程不足24 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腫瘤、血液、免疫相關(guān)基礎(chǔ)疾??；簽字同意采集外周血進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究。本研究已在西京醫(yī)院倫理委員會(huì)備案并通過審批(審批號(hào)：KY20193106)。

1.2分組和外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果 入組患者發(fā)病24 h內(nèi)收集外周血，分離PBMC并液氮凍存以長(zhǎng)期保存。共29例患者診斷為熱射病，按照預(yù)后分為生存組和死亡組，其中生存組18例，死亡組11例。隨機(jī)數(shù)字法選取6例生存患者和4例死亡患者PBMC提取總RNA，送廣州基迪奧公司進(jìn)行熱射病患者文庫制備和測(cè)序分析。

1.3差異基因篩選 將測(cè)序所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾。過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)通過Cufflinks程序求各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量值，構(gòu)建新的轉(zhuǎn)錄本。對(duì)新的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差異表達(dá)生物信息學(xué)分析。首先按照錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate， FDR)與兩組間表達(dá)量的比值(FC)，對(duì)其取以2為底的對(duì)數(shù)(log2FC)的值來篩選差異基因，條件為： FDR<0.05且|log2FC|>1。求得差異基因之后，利用GO和KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析關(guān)鍵通路，結(jié)合基因表達(dá)熱圖，篩選出與預(yù)后關(guān)聯(lián)最密切的基因。

1.4關(guān)鍵基因RT-PCR驗(yàn)證 提取存活組18例，死亡組11例患者PBMC的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京gennstar公司)予以反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，前引物0.5 μL，后引物0.5 μL，SYBR Green(北京gennstar公司) 5 μL，無RNA酶去離子水3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃持續(xù)2 min，模板變性；(95 ℃持續(xù)20 s，58 ℃持續(xù)15 s)×40次循環(huán)。所得Ct值按照2-△△Ct公式處理，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1兩組差異基因表達(dá)火山圖 測(cè)序文庫下機(jī)數(shù)據(jù)使用edgeR軟件進(jìn)行差異分析。結(jié)果顯示，篩選出明顯差異基因693個(gè)，與生存組比較死亡組表達(dá)上調(diào)基因326個(gè)，下調(diào)基因267個(gè)。見圖1。

注：與生存組比較，黃色點(diǎn)代表死亡組下調(diào)基因；紅色點(diǎn)代表死亡組上調(diào)基因；藍(lán)色點(diǎn)代表兩組無明顯差異基因圖1 兩組差異基因表達(dá)火山圖

2.2差異基因的GO功能注釋分析 GO 功能注釋分析發(fā)現(xiàn)富集最為明顯的前10個(gè)GOterm，主要參與的是免疫細(xì)胞調(diào)控和免疫進(jìn)程。包括：①細(xì)胞活化；②免疫系統(tǒng)過程；③免疫反應(yīng)；④白細(xì)胞活化；⑤髓樣白細(xì)胞活化；⑥中性粒細(xì)胞活化；⑦粒細(xì)胞活化；⑧白細(xì)胞脫粒；⑨中性粒細(xì)胞脫粒；⑩中性粒細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)。見圖2。

注：由紅色到藍(lán)色表示差異越明顯圖2 GOterm分類統(tǒng)計(jì)條形圖

2.3差異基因的KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)通路占主導(dǎo)地位，這些基因主要參與了金黃色葡萄球菌感染、利什曼病、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、造血干細(xì)胞譜系、趨化因子信號(hào)通路、黏著斑、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、擴(kuò)張型心肌病PI3k-AKT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等功能。見圖3。

注：由紅色到藍(lán)色表示差異越明顯圖3 KEGG通路富集柱狀圖

2.4目的基因篩選 經(jīng)過GO功能和KEGG富集解析，選取兩組間表達(dá)差異前40的基因繪制熱圖，其中與免疫細(xì)胞功能相關(guān)的基因有趨化因子(C-C基元)配體5[chemokine(C-C motif)ligand 5, CCL5]、基質(zhì)金屬蛋白酶8(MMP8)、MMP9。通過熱圖發(fā)現(xiàn)，死亡組患者CCL5表達(dá)上調(diào)，MMP8、MMP9表達(dá)均下降。見圖4。

注：藍(lán)色表示死亡組與生存組比較表達(dá)下調(diào)，紅色表示表達(dá)上調(diào)，顏色越深，差異越明顯圖4 兩組熱射病患者差異基因表達(dá)熱圖

2.5目的基因在兩組之間的表達(dá)情況 提取生存組18例、死亡組11例患者PBMC總RNA，RT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生存組比較，死亡組MMP8基因(P=0.8955)和MMP9基因(P=0.0597)無明顯下降；與生存組比較，死亡組CCL5基因表達(dá)明顯上調(diào)(t=7.056，P<0.05)。見圖5。

注：與生存組比較，a P<0.05圖5 兩組熱射病患者CCL5、MMP8和MMP9基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

熱射病是最嚴(yán)重的熱致疾病類型，起病突然，病情變化迅速、預(yù)后差、病死率很高。目前大多數(shù)研究集中于熱射病治療上面，對(duì)于影響熱射病預(yù)后的關(guān)鍵因素缺少深入的追蹤及解析，尤其是對(duì)于熱射病患者生存與死亡不同預(yù)后之間的潛在機(jī)制有待進(jìn)一步探究，熱射病預(yù)后的決定因素是什么也尚無相關(guān)研究[8]。當(dāng)前研究的熱點(diǎn)集中于肝腎損傷、凝血異常、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)等相關(guān)生物標(biāo)志物與預(yù)后的相關(guān)性分析[9]，但是目前尚無明確結(jié)論，也無內(nèi)在機(jī)制的進(jìn)一步研究。因此，需要一種新的揭示熱射病預(yù)后關(guān)鍵分子的方法進(jìn)行與預(yù)后相關(guān)可能基因的篩查。

基因測(cè)序技術(shù)普及，大量基礎(chǔ)研究通過基因測(cè)序揭示疾病預(yù)后關(guān)鍵基因[10]。由于PBMC容易獲取，通過PBMC測(cè)序進(jìn)行疾病研究已成為大多數(shù)科研單位的常規(guī)研究手段[11]。本研究通過收集熱射病患者PBMC，構(gòu)建測(cè)序數(shù)據(jù)庫，結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，尋找熱射病預(yù)后關(guān)鍵基因。通過初步篩查發(fā)現(xiàn)兩組患者之間存在693個(gè)明顯差異基因，與生存組比較，死亡組表達(dá)上調(diào)基因326個(gè)，下調(diào)基因267個(gè)。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫比對(duì)GO功能和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因集中最為明顯的前10個(gè)GOterm，主要參與的是免疫細(xì)胞調(diào)控和免疫進(jìn)程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)通路占主導(dǎo)地位，主要參與了趨化因子信號(hào)通路和炎癥性疾病。因此，可以認(rèn)為炎癥調(diào)控相關(guān)基因和通路決定熱射病患者預(yù)后。近年來的研究[12]提示，熱射病相關(guān)性SIRS可能是導(dǎo)致熱射病預(yù)后不良的重要因素。也有研究[13]通過動(dòng)物模型測(cè)序揭示了炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)基因，認(rèn)為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞是決定熱射病預(yù)后的決定因素。可見，炎癥相關(guān)基因確實(shí)是參與熱射病發(fā)展和預(yù)后調(diào)控的關(guān)鍵。

本研究通過生物信息學(xué)篩選和臨床樣本比對(duì)篩查發(fā)現(xiàn)CCL5在生存組患者中明顯升高，CCL5基因上調(diào)可能與熱射病預(yù)后不良有關(guān)。CCL5是重要的β趨化因子，具有N端CC結(jié)構(gòu)域，在免疫系統(tǒng)細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用，例如CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞均可以被募集，參與機(jī)體免疫調(diào)控[14]。CCL5在腫瘤中研究較多，在癌細(xì)胞增殖、凋亡抗性、耐藥性、遷移和侵襲中起到重要作用[15]。近年來發(fā)現(xiàn)[16]，CCL5可以通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2， BMPR2)參與肺血管平滑肌功能調(diào)節(jié)。抑制CCL5表達(dá)可以減少巨噬細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活[17]，可以減少成纖維細(xì)胞的炎癥損傷，減輕幼兒急性肺損傷[18]。目前在熱射病中尚未查閱到與熱射病相關(guān)的CCL5研究，但是CCL5通過募集免疫細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)[19]，通過調(diào)控血管平滑肌功能，調(diào)節(jié)機(jī)體血液循環(huán)系統(tǒng)，而這些方面的功能與熱射病預(yù)后有明確的相關(guān)性，因此進(jìn)一步深入的研究CCL5在熱射病預(yù)后中的確切機(jī)制，對(duì)于揭示熱射病預(yù)后不良的關(guān)鍵因素有一定作用。本研究樣本量較小，存在一定不足。

綜上所述，通過熱射病患者PBMC測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CCL5基因上調(diào)可能是熱射病預(yù)后的關(guān)鍵，但需要進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究探索具體機(jī)制。