基于IKK/IKB/NF-κB信號通路探討理中湯加味聯(lián)合穴位埋線干預非酒精性脂肪性肝炎大鼠的作用機制*

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是與遺傳易感和代謝功能障礙密切相關(guān)的脂肪性肝病，疾病譜包括單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝纖維化和肝硬化

。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，世界范圍內(nèi)普通人群NAFLD發(fā)病率已達28.01/1 000人年～52.34/1 000人年

。而在國內(nèi)，隨著肥胖和代謝綜合征的流行，NASH的發(fā)病率逐年上升，已成為我國第一大慢性肝病

。目前NASH缺乏理想的治療藥物，研究證實了中醫(yī)藥治療NASH的顯著療效

。前期的文獻和臨床研究結(jié)果表明，NASH發(fā)病的關(guān)鍵在于脾胃升降功能失職，據(jù)此我們采用理中湯加味聯(lián)合背俞穴位埋線治療NASH，這種聯(lián)合治療方案療效較單純中藥或單純背俞穴位埋線治療的療效更加顯著且療程縮短

。核因子-κB( NF-κB) 是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在肝臟炎癥反應、免疫應答、細胞生存和增生等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用

。NF-κB通過一系列信號轉(zhuǎn)導途徑被激活，進而促進炎癥因子的釋放，最終導致肝細胞壞死，激活炎癥級聯(lián)反應

。抑制IKK/IKB/NF-κB信號通路的激活是減輕肝組織炎癥反應的關(guān)鍵

。本研究利用理中湯加味聯(lián)合穴位埋線干預NASH模型大鼠，觀察其治療效果，探尋可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及造模 SPF級健康SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量(120±20)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號SCXK(湘)2016-0002]。適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機選10只作為空白組，其余60只以高脂飼料(膽固醇2%+豬油4%+標準飼料58%)喂養(yǎng)12周制備NASH大鼠模型。第12周末隨機處死10只大鼠進行肝組織活檢，組織病理切片陽性提示NASH造模成功；造模成功后，剩余50只大鼠隨機分為模型組、中藥+埋線組、穴埋組、中藥組、維生素E軟膠囊(西藥)組，每組10只。實驗動物按照國家實驗動物管理規(guī)定進行飼養(yǎng)和實驗。

1.2 主要試劑和儀器 大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(美國invitrogen公司)；Anti-IL6 抗體ab9324、Anti-IL1β抗體ab9722、Anti-NF-κB p65抗體ab16502、Anti-TNF-α抗體ab6671、Anti-IKK -α抗體ab32041(英國acbcam公司)；低溫冰箱(Thermo Forma 702)；光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；DYY-電泳儀、凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；7170S型全自動生化分析儀、低溫離心機(日本日立公司)。

1.3 實驗藥物 理中湯加味：人參、山藥、赤芍、丹參、山楂、首烏、益智仁、白芍各20 g，干姜、白術(shù)、炙甘草、茯苓、澤瀉各15 g，蒼術(shù)、陳皮、厚樸各10 g。上述藥品均為農(nóng)本方顆粒[培力(南寧)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)]，購于柳州市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，上方加500 ml蒸餾水煎煮，直至每2 ml藥液中的生藥含量約8.75 g。維生素E軟膠囊(桂南藥股份有限公司)。

1.4 干預方法 空白組大鼠正常飼養(yǎng)，模型組大鼠予高脂飲食至干預結(jié)束，埋線組大鼠參照文獻

，選取雙側(cè)脾俞、胃俞、肝俞、腎俞，常規(guī)皮膚消毒后，先從左側(cè)開始，用埋線針將長0.5 cm 0號羊腸線埋入穴位，同法操作右側(cè)，1次/周。中藥組大鼠予理中湯加味混懸液8.75 g·kg

·d

灌胃給藥，1次/d。中藥+埋線組大鼠聯(lián)合中藥組、埋線組治療方法進行治療。西藥組大鼠予維生素E軟膠囊250 mg·kg

·d

灌胃，1次/d。連續(xù)干預4周，期間繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)。

1.5 觀察指標 ①觀察大鼠一般情況，包括精神狀態(tài)、毛色、活動、大便、飲食、飲水等。②檢測大鼠肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量(g)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。③測定血清中肝功能(ALT、AST)、血脂(TC、TG、LDL-C)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)含量。胰島素抵抗指數(shù)按穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)(HOMA-IR)計算，計算公式為HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。④HE染色觀察肝組織形態(tài)。⑤檢測血清 IL-1β、IL-6、TNF-α含量。⑥檢測肝組織中IKK-α、NF-κB p65、IL-1β 、IL-6、TNF-α蛋白表達情況。

區(qū)縣級電視臺不重視優(yōu)秀人才培養(yǎng)，在制作電視專題節(jié)目時往往缺乏相應的獎罰機制，沒有將地區(qū)優(yōu)點以及特色體現(xiàn)出來，在節(jié)目題材選擇上存在缺乏吸引力的狀況，其所使用的多媒體技術(shù)以及相應的節(jié)目制作技術(shù)還存在著很大的提升空間，在宣傳方式和制作內(nèi)容上都還需要進一步提高。

2.6 各組大鼠 IKK-α、NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達情況 見圖2、3。

2.1 各組大鼠一般情況 空白組大鼠毛發(fā)色正常,活動敏捷,精神、納食、二便均正常,對外界反應靈敏。模型組及各干預組大鼠隨著喂養(yǎng)周期延長，體質(zhì)量出現(xiàn)進行性增加，毛發(fā)雜亂、色暗，納食減少，大便溏，精神倦怠，少動，對外界刺激反應遲鈍。干預后，各干預組大鼠進食、飲水及大便稀溏癥狀有所好轉(zhuǎn),體型肥胖不同程度減輕，大鼠毛色、精神、活動等方面均改善。其中中藥+埋線組大鼠在活動、動作、納食、二便、精神等方面，與空白組比較，肉眼觀察無明顯差異。

2 結(jié)果

在冬棚蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中不穩(wěn)定因素有很多，如氣候、天氣、水質(zhì)、底質(zhì)變化，苗種、管理等。如何保持穩(wěn)定，提高成活率？

2.2 各組大鼠肝臟組織形態(tài)變化情況 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見明顯脂肪變性及炎性細胞浸潤。模型組大鼠肝組織重度脂肪變，肝細胞有較大脂肪細胞廣泛浸潤，呈“氣球狀”改變，可見肝小葉內(nèi)為主的大量炎性細胞浸潤。中藥+埋線組大鼠肝臟脂肪變性不同程度減輕，肝細胞有再生現(xiàn)象，炎性細胞明顯降低甚至消失。埋線組大鼠肝臟脂肪變性程度有所減輕，肝細胞再生，炎性細胞減少。中藥組大鼠肝臟病理組織學變化性質(zhì)與埋線組相似。西藥組大鼠肝臟有脂肪變性和“氣球征”，肝小葉內(nèi)有少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α情況 見表3。

2.4 各組大鼠肝功能、血脂、HOMA-IR情況 見表2。

2.3 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕重、肝指數(shù)情況 見表1。

雪螢一怔：“江老師這不是帶給你了嗎？”狗子說：“他今天才給我的。以前那么久，他都沒給我。你一定是才買的?！毖┪灴扌Σ坏茫f：“是是是，阿姨太忙，忘了，對不起?！?/p>

3 討論

NASH以肝細胞脂肪變合并肝小葉內(nèi)炎癥和肝細胞氣球樣變性或伴有纖維化為特征，是非酒精性單純性脂肪肝進展至肝硬化及肝細胞癌的中間階段

。NASH治療的目標是阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病進展。NASH作為NAFLD發(fā)展的重要中間環(huán)節(jié)，是干預治療NAFLD的靶階段。目前NAFLD的主要治療方式包括改變生活方式、針對代謝綜合征的藥物以及減肥手術(shù)，然而這些治療難以使NASH逆轉(zhuǎn)，目前尚無公認的特效藥可以推薦作為NASH的常規(guī)治療

。近些年，中醫(yī)藥在治療NAFLD方面取得了可喜的成績，大量的臨床和基礎(chǔ)研究均表明中醫(yī)藥對NASH有明顯療效

。NASH的發(fā)生源于脾胃對飲食中的水谷精微的運化和輸布異常，最后導致痰、濕、濁、瘀、熱蘊結(jié)肝體，導致本病的發(fā)生，因而本病發(fā)生的關(guān)鍵在于脾胃升降功能失職

。且團隊通過對古籍文獻的整理發(fā)現(xiàn)，歷代醫(yī)家治療NASH多集中于溫陽、健脾、祛濕、理氣等方面

。據(jù)此我們使用理中湯加味治療NASH患者，并取得一定的療效。理中湯源于《傷寒論》，是治療脾胃運化失職的經(jīng)典方劑。我們在理中湯溫脾健運基礎(chǔ)上，加用茯苓、山藥益氣健脾；蒼術(shù)、陳皮、厚樸祛濕化痰、行氣和胃；赤芍、丹參、山楂清熱涼血散瘀；益智仁、澤瀉溫腎降濁；首烏、白芍養(yǎng)血柔肝。諸藥合用，以求標本兼治。前期研究發(fā)現(xiàn)，脾升胃降功能失衡的經(jīng)絡病機根本為任督二脈經(jīng)氣的升降交匯失衡，背俞穴位埋線可通過調(diào)節(jié)任督二脈經(jīng)氣之升降交匯，進而調(diào)理脾胃升降。穴位埋線有別于普通針刺的是其通過在固定穴位上埋入可吸收的羊腸線，達到持續(xù)刺激的作用，作用刺激更強，作用時間更久，療效更好。通過對肝俞、脾俞、胃俞、腎俞進行長期持續(xù)刺激作用，可提高其興奮性和傳導性，調(diào)節(jié)任督二脈經(jīng)氣之升降交匯，進一步發(fā)揮調(diào)理脾胃之功能。本研究結(jié)果顯示，干預后中藥+埋線組大鼠在進食飲水、體質(zhì)量、精神及活動等方面較其他干預組改善更為明顯。這可能與干預后大鼠脾胃恢復運化功能有關(guān)。

此外，除了晴雯與黛玉相似，我認為妙玉與黛玉也具有可比性，她們都是姑蘇人，妙玉也是一個有錢人家的子弟，她小時候也遇到了僧道，僧人建議她出家，最終妙玉選擇了代發(fā)修行，此外，她們都擅長寫詩，而且妙玉對寶玉也有一定的情愫，所以黛玉和妙玉也有可比性。

高脂飲食能引起血清中游離脂肪酸(FFA)增加，F(xiàn)FA在體內(nèi)不斷積累引起肝損傷，細胞膜通透性增高，導致細胞中ALT、AST溢出進入血液

，引起血清中ALT、AST含量上升。NASH的“多重平行打擊”發(fā)病機制已被廣泛接受。以IR為中心引起的肝臟脂肪浸潤產(chǎn)生大量FFA，機體氧化途徑無法處理過量FFA則會誘導TG及TC的合成，引起肝細胞脂質(zhì)過度積聚誘發(fā)脂肪變性

。同時FFA增多又可誘導活性氧簇物質(zhì)(ROS)的增加

。持續(xù)存在的ROS可以激活肝臟中Kupffer細胞(KCs)，釋放大量的細胞因子，如NF-κB。同時，IKK-α被肝組織中過量積累的FFA激活，通過激活I(lǐng)KK復合體將IκB蛋白磷酸化，使其蛋白酶體降解，促使NF-κB 磷酸化并轉(zhuǎn)運入細胞核，活化的NF-κB 在細胞核內(nèi)調(diào)控TNF-α、IL-6和IL-1β等相關(guān)炎癥細胞因子大量產(chǎn)生

，引起炎癥細胞浸潤，而同時NF-κB活化后釋放出來的炎癥因子可再次作用并激活NF-κB，放大炎癥反應級連，形成惡性循環(huán)

，促進和加重NASH的發(fā)生和發(fā)展。本實驗結(jié)果表明，中藥+埋線組大鼠較其他干預組HOMA-IR、TG、TC、 LDL-C 、炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平及肝組織IKK/IKB/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達下降更顯著。提示理中湯加味聯(lián)合穴位埋線可能改善NASH大鼠胰島素抵抗，降低血脂水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制IKK/IKB/NF-κB 信號通路活化，進而抑制炎癥反應保護肝臟。

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