外泌體在肝纖維化中的研究進(jìn)展*

肝纖維化是由于各種致病因子長(zhǎng)期刺激，如酒精、代謝異常、病毒、自身免疫反應(yīng)、膽汁淤積等，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成大于降解

。肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化

。肝纖維化可持續(xù)進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌，最終可能導(dǎo)致肝功能衰竭，甚至死亡

。目前尚無(wú)直接的抗纖維化藥物，臨床治療主要是針對(duì)病因以及對(duì)癥治療，因此研究肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。外泌體是由各種細(xì)胞分泌的一種直徑為30～100 nm的細(xì)胞外膜包裹的囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，由不同類型的細(xì)胞通過(guò)胞吐作用釋放到細(xì)胞外間隙或生物液中，這是細(xì)胞內(nèi)多囊體與質(zhì)膜融合的結(jié)果。外泌體的主要功能是細(xì)胞間的溝通。肝細(xì)胞既屬于釋放外泌體的細(xì)胞，也是內(nèi)源性外泌體和其他器官細(xì)胞來(lái)源的外泌體的靶細(xì)胞

。

1 外泌體在肝纖維化形成中的作用

研究表明許多信號(hào)通路以及細(xì)胞因子在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等細(xì)胞因子可以激活HSCs，調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、巨噬細(xì)胞極化和自噬，在肝纖維化過(guò)程中，各種細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體相互影響，共同調(diào)控細(xì)胞因子及細(xì)胞群發(fā)生一系列變化。

1.1 外泌體與TGF-β TGF-β家族信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移或細(xì)胞死亡等多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，這些過(guò)程對(duì)組織器官的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。TGF-β信號(hào)通路參與了肝臟疾病發(fā)展的各個(gè)階段，從最初的肝臟損傷到纖維化，再到肝硬化以及肝癌。然而，由于慢性肝損傷，高水平的TGF-β導(dǎo)致HSCs活化成肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致大量肝細(xì)胞死亡，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展

。TGF- β細(xì)胞因子有30多種，肝纖維化與TGF- β1最相關(guān)

。Smad蛋白家族是其下游介質(zhì)。肝臟長(zhǎng)期受損時(shí)，TGF-β1與其受體TGFβ-R結(jié)合，導(dǎo)致Smad2和Smad3發(fā)生磷酸化，須與Smad4結(jié)合轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，調(diào)控特定基因表達(dá)，激活信號(hào)通路，ECM合成過(guò)多引起肝纖維化，而Smad7拮抗TGF- β1所介導(dǎo)的纖維化

。TGF-β是一種主要的促纖維化細(xì)胞因子，有望成為治療纖維化的靶點(diǎn)

。體外研究表明，外泌體介導(dǎo)丙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞與HSCs細(xì)胞間通訊，丙型肝炎病毒感染肝細(xì)胞的外泌體攜帶miR-19a和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白-3靶基因，通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路而激活HSCs，誘導(dǎo)肝纖維化

。研究表明，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體移植到四氯化碳(CCl

)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠上，可顯著抑制TGF-β1/Smad通路，同時(shí)小鼠的Ⅰ/Ⅲ型膠原和TGF-β1發(fā)生下調(diào)

。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自然殺傷(NK)細(xì)胞中提取的外泌體可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞系細(xì)胞的增殖和活化，同時(shí)抑制CCl

誘導(dǎo)的肝纖維化

。研究發(fā)現(xiàn)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體過(guò)表達(dá)的miRNA-181-5p可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的促纖維化基因的上調(diào)，可減輕肝損傷，顯著下調(diào)肝組織I型膠原、波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和纖維連接蛋白的表達(dá)

。

這樣地又十分鐘過(guò)去了。我還沒(méi)有走。雨沒(méi)有住，車兒也沒(méi)有影蹤。她也依然焦灼地立著。我有一個(gè)殘忍的好奇心，如她這樣的在一重困難中，我要看她終于如何處理她自己。看著她這樣窘急，憐憫和旁觀的心理在我身中各占了一半。

1.2 外泌體與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是基質(zhì)細(xì)胞蛋白，在許多纖維化疾病中表達(dá)上調(diào)，并與TGF-β共表達(dá)，促進(jìn)活化的HSCs形成肝纖維化

。CTGF調(diào)控導(dǎo)致纖維化的多種過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、遷移、黏附、存活和ECM的產(chǎn)生

；TGF-β的促纖維化特性是通過(guò)CTGF介導(dǎo)的，作為TGF-β信號(hào)的下游和協(xié)同介質(zhì)，增加成纖維細(xì)胞增殖及強(qiáng)烈趨化作用，生成肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)形成大量ECM及過(guò)度積聚

。miR-199a-5p是由靜止的HSCs產(chǎn)生的，并從靜止的HSCs外泌體遞送到活化的HSCs，這是由于miR-199a-5p直接靶向促纖維化分子CTGF的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)導(dǎo)致CTGF及其下游靶點(diǎn)a-SMA和膠原1的表達(dá)減少

。與活化的HSCs釋放的外泌體相比，靜止的HSCs分泌的外泌體中miR-214的水平增加，抑制其直接靶向CTGF的表達(dá)，并下調(diào)CTGF下游的α-SMA和膠原的表達(dá)

。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，給予正常肝細(xì)胞外泌體后，間質(zhì)膠原沉積、α-SMA和CTGF的mRNA/蛋白表達(dá)下調(diào)

。

1.3 外泌體與炎癥因子 由幼稚骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDM)產(chǎn)生的外泌體包含有抗炎的microRNA-99a/146b/378a。白細(xì)胞介素4(IL-4)誘導(dǎo)BMDM極化產(chǎn)生的外泌體增加

。人類經(jīng)血干細(xì)胞來(lái)源的外泌體直接改變HSCs的活化狀態(tài)，減少促纖維化因子的沉積和促炎因子的分泌，有利于正常肝細(xì)胞增殖和存活

。使用人經(jīng)血源性干細(xì)胞來(lái)源外泌體降低了促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β)的水平，改善了肝功能

。在CCl

誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠體內(nèi)注射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可有效減輕肝纖維化，包括減少膠原堆積，改善肝功能，抑制炎癥，促進(jìn)肝細(xì)胞再生。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以降低肝組織炎癥和壞死，降低血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、干擾素-γ、IL-6、IL-18和IL-1β的含量

，被認(rèn)為與炎癥和ECM重塑的調(diào)節(jié)有關(guān)

。根據(jù)膠原面積、Ishak纖維化評(píng)分、MDA、IL-1和IL-6水平測(cè)定，其抗肝纖維化作用明顯強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

。受損的肝細(xì)胞通過(guò)分泌外泌體而引起炎癥，激活HSCs等啟動(dòng)修復(fù)反應(yīng)

。

大豆卵磷脂稀釋液是近年稀釋液研究的熱點(diǎn)，F(xiàn)orouzanfar等[8]在冷凍保存綿羊精液試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黃，證明大豆卵磷脂可以替代卵黃。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低溫與常溫下保存綿羊精液，結(jié)果表明精子在卵黃中的運(yùn)動(dòng)性較差。本試驗(yàn)在0 ℃冰水混合物中保存綿羊精液，發(fā)現(xiàn)使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黃保存精子效果顯著高于其他濃度(P<0. 05)，與蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最優(yōu)添加量有一定偏差。所以證明為了確保精子的運(yùn)動(dòng)處于最好的狀態(tài)，大豆卵磷的添加劑量必須有一定的限度。

1.6 外泌體與氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激反映了活性氧(ROS)的產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)清除能力之間的平衡。過(guò)多的ROS堆積, 使宿主一些生物大分子物質(zhì)，如DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等產(chǎn)生氧化作用，這個(gè)過(guò)程稱為氧化應(yīng)激。激活過(guò)程的中心是氧化自由基產(chǎn)生增加，其調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號(hào)通路，進(jìn)一步導(dǎo)致ECM過(guò)度產(chǎn)生

。ROS刺激肝細(xì)胞的壞死和凋亡，導(dǎo)致肝損傷，進(jìn)展終末期肝病

。氧化應(yīng)激介導(dǎo)肝纖維化的進(jìn)展，其相關(guān)分子可能是參與肝纖維化的分子和細(xì)胞的中介物。ROS還刺激KCs細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生促纖維化介質(zhì)，并直接激活HSCs，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生

。研究表明，人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體與常用的肝保護(hù)劑聯(lián)苯雙酯比較，具有更明顯的抗氧化和保肝作用，其通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用抑制CCl

誘導(dǎo)的肝損傷

。不同來(lái)源的外泌體通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠抑制HSCs的激活，減少炎癥和細(xì)胞凋亡，抗氧化應(yīng)激，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，有助于減輕肝纖維化

。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞的外泌體植入各種體內(nèi)模型中，具有抑制促炎，減少氧化應(yīng)激和抗肝纖維化作用

。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在小鼠肝損傷模型中具有抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡的作用，能夠改善肝功能

。

1.4 外泌體與巨噬細(xì)胞 HSCs和巨噬細(xì)胞在肝纖維化中起重要作用。這兩種細(xì)胞類型相互作用，重塑肝纖維化中的ECM和免疫微環(huán)境。巨噬細(xì)胞表型會(huì)根據(jù)炎癥和纖維化持續(xù)時(shí)間和程度而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化

。肝臟中巨噬細(xì)胞的來(lái)源主要有兩種，一種是由組織駐留吞噬細(xì)胞組成，稱為枯否細(xì)胞(KCs)，在維持肝功能和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用

。另一種是被單核細(xì)胞通過(guò)趨化因子信號(hào)被招募到受損的肝臟而活化成的巨噬細(xì)胞

。巨噬細(xì)胞根據(jù)功能可以分為兩種類型：經(jīng)典活化促炎M1型和替代活化抗炎M2型

。巨噬細(xì)胞通過(guò)協(xié)調(diào)炎癥、增殖和血管生成過(guò)程，從促炎M1轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡譓2占主導(dǎo)地位。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體也明顯抑制M1小膠質(zhì)細(xì)胞極化，增加M2小膠質(zhì)細(xì)胞

。在免疫系統(tǒng)中，外泌體已被證明通過(guò)傳播與MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ分子相關(guān)的抗原參與抗原遞呈，在介導(dǎo)適應(yīng)性和先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用

。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的特異性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，如MMP9，它能降解基底膜，招募炎癥因子和成纖維細(xì)胞進(jìn)入損傷部位。巨噬細(xì)胞還與體內(nèi)產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞密切相關(guān)，并產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的活性

。免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞外泌體途徑代表了免疫細(xì)胞之間抗原轉(zhuǎn)移的一種新的非細(xì)胞相關(guān)機(jī)制，這可以對(duì)幼稚細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響。巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體被鄰近的免疫細(xì)胞攝取，可能導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)和炎癥刺激的改變

。研究發(fā)現(xiàn)將特定的RNA招募到溶酶體中進(jìn)行降解，融合蛋白能夠整合到外泌體中。運(yùn)送含有Lamp2b-Hur基因的外泌體顯著改善肝纖維化，同時(shí)降低了miR-155和其他炎癥基因。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該系統(tǒng)對(duì)溶酶體富集的巨噬細(xì)胞內(nèi)源性HUR具有顯性-負(fù)性作用

。研究證實(shí)肝臟lncRNA H19水平與巨噬細(xì)胞活化和肝纖維化密切相關(guān)。富含H19的外泌體增強(qiáng)KCs細(xì)胞活化的M1極化，促進(jìn)骨髓源性巨噬細(xì)胞的募集和分化

?？傊?，外泌體可能對(duì)巨噬細(xì)胞和HSCs在慢性肝病進(jìn)展過(guò)程中起著重要作用。

1.5 外泌體與自噬 自噬對(duì)于肝纖維化具有雙重作用，一方面通過(guò)HSCs活化導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生，另一方面通過(guò)降低肝細(xì)胞死亡、調(diào)控巨噬細(xì)胞抑制炎癥因子釋放發(fā)揮抗纖維化作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬是維持肝實(shí)質(zhì)(肝細(xì)胞)和非實(shí)質(zhì)(HSCs、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、KCs細(xì)胞)肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵

。外泌體的形成與自噬間有著共同的分子機(jī)制，兩者具有實(shí)質(zhì)性的相互作用關(guān)系。外泌體調(diào)控自噬的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3/Bcl-2)信號(hào)通路

。慢性酒精性肝病引起自噬途徑中的多個(gè)基因受影響和外泌體分泌增加，影響溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1)和LAMP2以損害溶酶體水平的自噬通量。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-155是調(diào)節(jié)肝巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞自噬和外泌體產(chǎn)生的關(guān)鍵因子

。脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以被用來(lái)向HSCs運(yùn)送miRNAs，來(lái)自miR181-5p-ADSCs的外泌體下調(diào)HST-T6細(xì)胞中STAT3和Bcl-2的表達(dá)，并激活自噬，可減輕肝損傷

。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，來(lái)源MMU-CIRC-0000623修飾的ADSCs外泌體，通過(guò)促進(jìn)自噬活化，顯著抑制了CCl

誘導(dǎo)的肝纖維化

。TRIB3介導(dǎo)的自噬損傷不僅抑制了晚期內(nèi)小體的自噬降解，而且促進(jìn)肝細(xì)胞分泌富含INHBA/激活素A的外泌體，導(dǎo)致HSCs的遷移、增殖和激活

。

2 外泌體在肝纖維化診斷中應(yīng)用

外泌體不僅可以將信號(hào)傳遞給受體細(xì)胞，還參與了細(xì)胞廢物的處理，被認(rèn)為是各種疾病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物

。外泌體參與肝臟內(nèi)細(xì)胞間通訊，并且對(duì)肝臟病理生理有重要作用。外泌體作為肝病新的診斷和預(yù)后的分子生物標(biāo)志物，同時(shí)作為新的治療方式

。肝組織活檢是診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作具有侵入性，費(fèi)用昂貴，對(duì)患者存在風(fēng)險(xiǎn)等劣勢(shì)。由于外泌體是患者潛在病理狀態(tài)的“指紋”，用于識(shí)別和評(píng)估與肝纖維化相關(guān)的分子特征。此外，外泌體成分受到保護(hù)，不受蛋白酶降解，因此可以在循環(huán)血漿和血清中被檢測(cè)到，在臨床應(yīng)用中成為理想的生物標(biāo)記物

。研究表明感染HCV可導(dǎo)致肝細(xì)胞釋放外泌體miRNA-19及靶向分子SOCS3至HSCs膜上，并與其膜上相應(yīng)受體結(jié)合后促進(jìn)HSCs活化。與健康者比較，慢性HCV感染所致的肝纖維化患者血清中miRNA-19a水平升高顯著。有專家指出，循環(huán)血清中外泌體miRNA-19a水平可能成為肝纖維化程度及預(yù)后評(píng)估的潛在新型生物學(xué)指標(biāo)之一

。

抗日戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)期，受黨的指引的生活書店，雖在國(guó)統(tǒng)區(qū)出版工作嚴(yán)重受阻，但仍能夠沖破國(guó)民黨當(dāng)局“文化圍剿”，積極傳播社會(huì)主義思潮、播撒馬列思主義文藝種子、推動(dòng)早期延安文藝在國(guó)統(tǒng)區(qū)的傳播，其出版發(fā)行的文學(xué)期刊具有強(qiáng)烈的社會(huì)使命感與歷史責(zé)任感，動(dòng)員了一大批愛(ài)國(guó)青年讀者走上革命道路；生活書店堅(jiān)持正確的價(jià)值導(dǎo)向，[4]在國(guó)統(tǒng)區(qū)出版發(fā)行進(jìn)步的文學(xué)期刊，為我黨的思想文化傳播開(kāi)辟了一條重要通道。另外，生活書店正確的思想導(dǎo)向，還有力地推動(dòng)了中國(guó)進(jìn)步文學(xué)、文化的生產(chǎn)、傳播，乃至在新中國(guó)文化出版事業(yè)的人才儲(chǔ)備和培養(yǎng)方面也具有不可磨滅的功績(jī)。

3 外泌體與中醫(yī)藥防治肝纖維化

中醫(yī)診療強(qiáng)調(diào)通過(guò)望、聞、問(wèn)、切辨證，其理論體系的基本特點(diǎn)為“整體觀念”和“辨證論治”。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基于分子水平、基因測(cè)序以及蛋白組學(xué)等微觀途徑掌握生命的本質(zhì)規(guī)律。外泌體的生物學(xué)特征體現(xiàn)了其在生命代謝活動(dòng)中的重要作用。目前大量中藥抗肝纖維化的研究都是局限于通過(guò)單一途徑，調(diào)節(jié)TGF-β、CTGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等來(lái)抑制HSCs活化，誘導(dǎo)活化的HSCs凋亡，促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)和抑制瘦素的分泌

。中藥復(fù)方基于中醫(yī)整體觀念及辨證論治理論體系，按照“君、臣、佐、使”原則配伍而成。其成分的多元化決定了其作用的多途徑、多環(huán)節(jié)

。因此研究中醫(yī)藥防治肝纖維化從單一的信號(hào)通路或分子為切入點(diǎn)尚不夠全面。雖然目前在中醫(yī)藥領(lǐng)域用外泌體防治肝纖維化的研究甚少，但外泌體對(duì)肝纖維化的發(fā)生、進(jìn)展、防治以及診斷的影響存在廣泛性，與中醫(yī)藥防治肝纖維化的多靶點(diǎn)相契合。外泌體作為細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的載體，包含所有誘導(dǎo)纖維化消退的必要成分，包括抑制巨噬細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的分泌；重塑ECM的產(chǎn)生，減少纖維瘢痕；滅活HSCs

。

4 展望

綜上所述，外泌體通過(guò)參與肝纖維化信號(hào)通路，對(duì)HSCs的遷移，調(diào)控炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞、自噬以及氧化應(yīng)激等實(shí)現(xiàn)對(duì)肝纖維化的調(diào)節(jié)。外泌體在肝纖維化微環(huán)境中處于相對(duì)重要的地位，參與到肝纖維化的防治以及診斷等多個(gè)環(huán)節(jié)，繼續(xù)進(jìn)行深入研究，有望找到防治甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新方法。由于外泌體是患者潛在病理狀態(tài)的“指紋”，它們可能代表一種新的生物標(biāo)記物，用于識(shí)別和評(píng)估與肝纖維化相關(guān)的分子特征，成為診斷肝纖維化或判斷其預(yù)后的可靠標(biāo)志物。外泌體可通過(guò)多方面影響肝纖維化的進(jìn)展，而中醫(yī)藥可通過(guò)多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)防治肝纖維化，以外泌體為切入點(diǎn), 或許可更全面地研究中醫(yī)藥防治肝纖維化的作用機(jī)制以及提供客觀、量化、整體性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)如今在外泌體領(lǐng)域，缺乏中醫(yī)藥防治肝纖維化方面研究。下一步將進(jìn)一步研究中醫(yī)藥在外泌體方面作用，為闡明中醫(yī)藥抗肝纖維化作用機(jī)制提供更多依據(jù)。

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