VEGF-A及PI3K/AKT通路在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

徐潤強，劉宇平，張海良，劉海盛，劉鈺君，姚金科*

伴隨結(jié)直腸癌分子生物學(xué)機制研究深入，多種基因、酶類及信號通路在其發(fā)生發(fā)展中受到高度關(guān)注。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A是一種具有高活性的功能性糖蛋白，具有誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、新血管生成及通透性增加等功能，已被證實為多種惡性腫瘤的正向調(diào)節(jié)因子和聯(lián)合治療靶點［1-3］。研究指出［4］，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，其異?；罨髮?xì)胞凋亡抑制明顯，而加速細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)移速度，并可促進(jìn)腫瘤新血管生成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲。目前VEGF-A與PI3K/AKT通路在結(jié)直腸癌中研究相對較少，而研究其對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展影響，對于腫瘤早期診斷、藥物治療靶點開發(fā)及預(yù)后監(jiān)測等具有重要意義，因此筆者基于此課題展開研究，旨在為臨床提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象選取廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院2013年9月到2015年9月間收治的結(jié)直腸癌根治術(shù)患者80例為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)［5］：①均符合結(jié)直腸癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷證實；②無合并嚴(yán)的心腦血管、肝腎肺等實質(zhì)性臟器組織疾?。虎劬邮苁中g(shù)治療且術(shù)前無放化療、靶向治療等治療史；④所有患者均對本次研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有胃癌、肝癌等其他類型惡性腫瘤者；②合并有HIV等嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病者；③臨床病理資料不完整或標(biāo)本欠理想。同時切取患者癌旁正常腸黏膜組織（距離腫瘤≥5 cm）作為對照組。所有研究對象男性45例、女性35例，年齡在20~87歲，平均年齡為（56.28±11.31）歲，腫瘤部位：結(jié)腸49例、直腸31例。本研究經(jīng)院內(nèi)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器一抗（羊抗PI3K、鼠抗AKT、VEGF-A抗體）和兔鼠通用型超敏二抗均購自圣塔克魯茲公司，DAB染色液［金瑞博（廈門）生物科技有限公司］，蘇木素染色液（河北博海生物工程開發(fā)有限公司），德國LEICA-CM3050S型冰凍切片機，奧林巴斯OLYMPUSBX51T-32000-2型生物三目顯微鏡。

1.2.2 免疫組化法80例結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織4%中性緩沖甲醛固定，常規(guī)制作石蠟包埋組織，石蠟組織5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)自然冷卻后在醫(yī)用雙氧水下浸泡10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水充分洗凈，置于PBS中浸泡5 min，分別滴加VEGF-A（abcam編號ab1316）及PI3K（abcam編號ab140307）及AKT抗體（abcam編號ab8805），隨后置于4℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后加入二抗37℃孵育30 min，滴加免疫顯色試劑（丹麥DaKO，批號20077835B），室溫環(huán)境孵育20 min，PBS漂洗后滴加以DAB顯色，顯微鏡下控色，依次蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片，高年資病理醫(yī)師于顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié)果判讀［6］：采用雙盲法進(jìn)行讀片，癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，未出現(xiàn)則為陰性細(xì)胞，采用染色程度與染色細(xì)胞比例評分之和作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，其中染色程度：無染色（0分）、淡黃色（1分）、黃色（2分）及棕黃色（3分），陽性細(xì)胞比例：≤5.0%（0分）、6.0%~10.0%（1分）、11.0%~20.0%（2分）、21.0%~50.0%（3分）及＞50.0%（4分），兩項得分相乘，總得分≤2分為陰性表達(dá)、3~4分為弱陽性表達(dá)（+），6~8分為中等強度陽性表達(dá)（++），9~12分為中等強度陽性表達(dá)（+++）。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組標(biāo)本組織的VEGF-A及PI3K及AKT表達(dá)陽性率；②單因素分析結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料相關(guān)性；③所有病例隨訪截止時間為2020年10月1日，比較結(jié)直腸癌VEGF-A、PI3K及AKT陽性和陰性表達(dá)患者5年生存率，并繪制生存曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均由SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中計數(shù)資料以例數(shù)/百分比（n/%）表示，采用χ2檢驗，并采用單因素分析各指標(biāo)相關(guān)性，相關(guān)性分析采用Spearman法，生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法比較，并繪制生存曲線，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率比較

VEGF-A及PI3K及AKT在觀察組結(jié)直腸癌組織中大部分呈中等和強陽性表達(dá)（圖1），對照組中的癌旁正常腸黏膜大部分為陰性表達(dá)或弱陽性表達(dá)，無強陽性表達(dá)。將中等強度以上表達(dá)定義為本研究的陽性表達(dá)病例，不表達(dá)或弱陽性定義為本研究的陰性表達(dá)病例，計算陽性率。統(tǒng)計結(jié)果顯示觀察組的VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率均明顯高于對照組（P＜0.05），詳見表1。

表1 結(jié)直腸癌及癌旁正常黏膜組織中VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)陽性率比較［n（%）］

2.2 VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征相關(guān)性

結(jié)直腸癌患者的VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位等臨床資料無明顯相關(guān)性（P＞0.05），與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度明顯相關(guān)（P＜0.05），詳見表2。

2.3 VEGF-A與PI3K、AKT的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中的VEGF-A表達(dá)與PI3K、AKT表達(dá)均呈現(xiàn)明顯正相關(guān)關(guān)系（分別r=0.625，P=0.001；r=0.517，P=0.001）。

2.4 VEGF-A、PI3K及AKT表達(dá)患者生存率比較

結(jié)直腸癌患者中位隨訪時間為5.2年，失訪3例，均按死亡計算，死亡例數(shù)46例，中位生存期為3.4年，VEGF-A、PI3K及AKT陽性表達(dá)患者的5年生存率均明顯低于陰性組（P＜0.05），詳見圖2。

3 討論

研究指出［7］，結(jié)直腸癌發(fā)病受多種因素影響，包括不良生活飲食習(xí)慣、遺傳易感性及腸道良性病變等因素，發(fā)病機制較為復(fù)雜，涉及多因素、多因子、多步驟及多階段參與，其中癌基因激活與抑癌基因抑制其重要作用。目前，結(jié)直腸癌可采用手術(shù)、放化療及靶向治療等措施，但其病情整體緩解率偏低，仍具有較高的疾病復(fù)發(fā)率，總體治療有效率不足35.0%［8］，因此深入研究結(jié)直腸癌發(fā)病分子生物學(xué)機制，可對早期診斷、治療及藥物研發(fā)提供重要指導(dǎo)。VEGF是一種高度特異性促血管內(nèi)皮生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及新血管生成和通透性增加等作用，基礎(chǔ)研究證實［9］，VEGF在癌細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲和黏附過程中發(fā)揮重要作用，包括促進(jìn)癌細(xì)胞入血轉(zhuǎn)移和提高癌組織血流灌注，導(dǎo)致癌細(xì)胞活性增強和轉(zhuǎn)移侵襲，最終造成病情發(fā)展惡化。VEGF-A是屬于VEGF家族成員之一，多由炎性浸潤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌，正常機體內(nèi)幾乎無表達(dá)，但高表達(dá)于腫瘤等血供豐富和代謝旺盛組織，屬于強效促腫瘤細(xì)胞和血管生長因子［10］。VEGF-A基因位于第6號染色體6p12位置，其中VEGF-A在新血管生成量多的組織表達(dá)較高，包括胎盤、幾乎所有腫瘤、炎性疾病及缺血性心臟病等。實驗研究表明［11］，VEGF-A能改變樹突狀細(xì)胞功能，抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞攻擊，并可促進(jìn)腫瘤新血管生成，此外還可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）-2表達(dá)，促進(jìn)淋巴管形成及腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移。最新有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A在腸癌中多呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤組織新血管生成和通透性增加，參與癌細(xì)胞增殖和侵襲擴(kuò)散。朱凱旋等［12］研究指出，VEGF-A在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM高分期患者中表達(dá)更高，參與患者病情發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲。本研究結(jié)果顯示，癌組織中的VEGF-A表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織，且與結(jié)直腸癌患者的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵襲深度密切相關(guān)，提示VEGF-A異常高表達(dá)參與結(jié)直腸癌患者病情發(fā)生進(jìn)展，與目前報道基本一致。

PI3K/AKT信號通路是體內(nèi)重要的調(diào)控通路，正常情況下參與多種細(xì)胞基本功能，包括細(xì)胞生長增殖、凋亡、代謝及轉(zhuǎn)錄翻譯等，但該通路異?；罨罂梢种萍?xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和新血管生成，參與多種癌癥、糖尿病等發(fā)生發(fā)展［13］。近年來，結(jié)直腸癌患者PI3K/AKT信號通路異?；罨芯枯^多，已被證實其具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成，以及抑制癌細(xì)胞凋亡和調(diào)控癌細(xì)胞增殖周期等多種功能。Waniczek等［14］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路異?；罨驛KT可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向癌細(xì)胞傳達(dá)生存信號，并能抑制不依賴p53途徑的細(xì)胞凋亡。Waniczek D等［15］研究指出，肝細(xì)胞生長因子（HGF）可經(jīng)PI3K/AKT通路促進(jìn)VEGF表達(dá)，當(dāng)PI3K/AKT通路異?；罨?，導(dǎo)致VEGF高表達(dá)，并能經(jīng)NF-κB和beta-catenin表達(dá)，最終誘導(dǎo)結(jié)直腸癌血管形成和轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌實驗研究發(fā)現(xiàn)［16］，PI3K/AKT通路異?；罨烧T導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依賴性激酶（CDKs）高表達(dá)，抑制p27KIP1等基因表達(dá)，縮短細(xì)胞周期G1期時間，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，同時還能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，增強癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，參與結(jié)直腸癌病情發(fā)生發(fā)展。但也有研究指出［17，18］，PI3K/AKT信號通路異?；罨瘍H為結(jié)直腸癌發(fā)病的早期事件，早期PI3K、AKT蛋白表達(dá)即處于高水平，與病情進(jìn)展和預(yù)后無明顯關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織的PI3K和AKT表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、分化越低、淋巴結(jié)存在轉(zhuǎn)移及侵襲深度越深患者的PI3K和AKT表達(dá)陽性率明顯更高，且術(shù)后隨訪5年，結(jié)直腸癌VEGF-A及PI3K及AKT陽性表達(dá)患者的5年生存率均明顯低于陰性組，提示PI3K/AKT信號通路不僅參與結(jié)直腸癌發(fā)病，且對病情發(fā)生發(fā)展和預(yù)后起著重要作用［19］。且本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中VEGF-A表達(dá)與PI3K和AKT呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，提示VEGF-A與PI3K/AKT通路可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起到協(xié)同效應(yīng)［20］。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中的VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表達(dá)現(xiàn)象，且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化及浸潤深度呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，并能減少患者生存期，三者在結(jié)直腸癌中高表達(dá)具有密切相關(guān)性，可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，對臨床診斷及治療具有重要意義。