• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅腳艾蒿的轉(zhuǎn)錄組解析

    2022-01-24 08:55:20徐世強(qiáng)孫銘陽李靜宇張聞婷王繼華
    廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:艾蒿堿基氨基酸

    梅 瑜,徐世強(qiáng),顧 艷,孫銘陽,周 芳,李靜宇,張聞婷,王繼華

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室/廣東省道地南藥資源保護(hù)與利用工程中心,廣東 廣州 510640)

    【研究意義】藥用植物遺傳資源是優(yōu)良品種選育的基礎(chǔ)。近年來隨著市場需求的增長,導(dǎo)致野生資源枯竭、馴化栽培品種品質(zhì)參差不齊。利用高通量測序技術(shù)能夠精準(zhǔn)評價藥用資源,解析其藥用活性的合成途徑和調(diào)控機(jī)制,有利于藥用資源的保護(hù)和利用?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】艾蒿(Artemisia argyi),是菊科蒿屬植物,多年生草本或略呈半灌木狀,具濃烈香氣,全草入藥,有溫經(jīng)、祛濕、散寒、止血、安胎、通經(jīng)活絡(luò)等功效。艾蒿中的揮發(fā)油類[1]、黃酮類、萜類、生物堿類、多糖類[2]等天然化學(xué)產(chǎn)物和大量微量元素[3],具有鎮(zhèn)咳平喘、殺菌消炎、益氣活血、溫經(jīng)活絡(luò)、抗氧化等功效[4],艾灸具有增強(qiáng)免疫力和抗炎作用。其黃酮的主要成分包括甲基黃酮類、槲皮素和柚皮素等[5]。胡倩等[6]利用AB-8 型大孔樹脂分離純化了艾葉總黃酮提取物(TFEFAA),采用HPLC分析獲得TFEFAA 的主要成分為棕矢車菊素和異澤蘭黃素,雖然其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別只有0.6%和0.20%,但能顯著增加SOD 酶、GSHPx 酶活力,且降低MDA 含量,能有效清除自由基和提高機(jī)體抗氧化能力。艾蒿還可作為天然的殺蟲劑、植物染料和飼料添加劑。艾蒿藥用功能顯著、價格低廉,因此在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域被廣泛利用,也受到學(xué)者們青睞。艾蒿品種較多,分布較為廣泛,藥用歷史悠久。梅全喜[7]記載艾蒿20 多種,紅足蒿(紅腳艾)是其中之一。三元宮碑文記載,1600 年前葛洪、鮑菇夫婦在羅浮山用紅腳艾為當(dāng)?shù)匕傩罩尾?,因此羅浮山紅腳艾在嶺南地區(qū)較有代表性,又稱“紅艾”“鮑姑艾”,別名神艾,與北艾、蘄艾同屬于菊科蒿屬艾草種植物。嶺南紅腳艾為菊科紅足蒿(Artemisia rubripesNakai),生長在陽光充足的田野,莖枝呈紫紅色,多有橫臥地下根狀莖伴匍匐生長,植株最高1 m 左右,香氣醇厚,基本為野生。紅腳艾常用于艾灸,是臨床應(yīng)用艾葉的來源之一。其蛋白質(zhì)中含有16 種常見氨基酸,7 種為必需氨基酸,必需氨基酸占總氨基酸的40.97%,功能性氨基酸占總氨基酸的53.6%,且葉小絨少,味略苦(其他品系艾草較苦)[8],因此廣東當(dāng)?shù)厝顺⒓t腳艾用作主要的食材原料之一?!颈狙芯壳腥朦c】目前,艾蒿的研究多集中于化學(xué)成分的分離鑒定、提取工藝優(yōu)化,以及藥理作用研究,而紅腳艾相關(guān)研究較少,尤其對紅腳艾組學(xué)研究和次生代謝產(chǎn)物合成途徑解析及化合物合成關(guān)鍵基因鑒定等未見報道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】由于紅腳艾基因組信息缺乏,本研究利用高通量測序平臺Illumina HiSeq 2500,選擇紅腳艾不同組織進(jìn)行混合DNA 池測序,通過Trinity 軟件de novo 組裝獲得紅腳艾轉(zhuǎn)錄組Unigene 庫,并基于公共數(shù)據(jù)庫對Unigene 進(jìn)行功能注釋,為后續(xù)的次生代謝產(chǎn)物合成途徑研究、相關(guān)功能基因挖掘及驗證提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試材料紅腳艾蒿(A.rubripesNakai)種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所南藥資源圃,由王繼華研究員鑒定。選擇長勢基本一致的健康植株,采摘葉片,用錫箔紙包裹迅速置于液氮中。

    1.2 紅腳艾RNA 的提取

    紅腳艾總RNA 采用生工生物Total RNA Extractor kit(B511311-0025)進(jìn)行提取,用1%瓊脂糖電泳檢測總RNA 的完整性,用Qubit?2.0熒光計Life Tech(Invitrogen)對總RNA 進(jìn)行定量。

    1.3 轉(zhuǎn)錄組測序與功能注釋

    紅腳艾RNA 樣品檢測合格后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。利用Illumina?NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit 制備測序文庫,之后使用Agilent Bioanalyzer 2100 評估文庫質(zhì)量;構(gòu)建合格文庫后,利用Illumina Hiseq 2500 平臺進(jìn)行測序,獲得雙端測序數(shù)據(jù);過濾原始數(shù)據(jù)中的接頭、低質(zhì)量(reads≤35 nt)和ploy-N 堿基的序列,獲得clean data,計算GC、Q20、Q30 含量及序列重復(fù)水平;采用Trinity 軟件進(jìn)行de novo 拼接組裝,用RSeQC 軟件去除冗余序列獲得Unigene,并評估基因表達(dá)水平[9-10]。利用BLAST 軟件[11],基于NR、GO、COG、KOG、KEGG 等數(shù)據(jù)庫[12-18]對組裝的Unigene 進(jìn)行功能注釋。

    1.4 SSR 鑒定及分析

    使用MISA 微衛(wèi)星識別工具鑒定簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)并進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紅腳艾轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

    利用Illumina Hiseq 2500 平臺對紅腳艾RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后,去掉含有接頭和低質(zhì)量的序列,共得到7.24 Gb clean data,24 126 043 條reads,GC 含量為44.67%,各樣品Q30 堿基百分比均不小于92.57%,說明文庫構(gòu)建質(zhì)量良好,試驗數(shù)據(jù)可靠。經(jīng)de novo 組裝,共得到173 093個轉(zhuǎn)錄本,平均長度為891.24 bp,N50 為1 406 bp,序列長度大于500 bp 的有96 861 個,占總序列數(shù)目的55.96%;轉(zhuǎn)錄本去冗余后得到85 991 個Unigene,平均長度為616.87 bp,N50 為925 bp,其中30 533 個(35.51%)序列長度大于500 bp,有14 408 個(16.75%)序列長度在1 000 bp 以上(表1)。

    表1 紅腳艾轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Statistics of transcriptome sequencing results of Artemisia rubripes Nakai

    2.2 Unigene 功能注釋

    通過BLAST軟件將獲得的85 991個Unigene序列與不同功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,共注釋到47 216個(54.91%)Unigene(表2)。其中,NR數(shù)據(jù)庫(40 802個,47.45%)、KOG數(shù)據(jù)庫(26 171個,30.43%)、GO數(shù)據(jù)庫(23 203個,26.98%)和KEGG數(shù)據(jù)庫(16 846個,19.59%),COG數(shù)據(jù)庫注釋到的Unigene數(shù)量最少(12 810個,14.9%)。

    表2 Unigene 的功能注釋統(tǒng)計Table 2 Statistics of functional annotation of Unigene

    2.2.1 NR 功能注釋 NR 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示,紅腳艾與向日葵(Helianthus annuus)的單基因匹配率(13 552 個,15.76%)最高,其次是萵苣(Lactuca sativa,9 187 個,10.68%)、洋薊(Cynara cardunculusvar.scolymus,6 609 個,7.69%),與菊花(Chrysanthemum×morifolium)、莫氏黑粉菌(Moesziomyces antarcticusT-34)、青稞(Hordeum vulgaresubsp.Vulgare)的單基因匹配均小于400個??梢?,紅腳艾與菊目菊科物種的相似度高。

    2.2.2 GO 功能注釋 GO 注釋結(jié)果(圖1)顯示,紅腳艾有23 203 個Unigene 被歸為生物過程(43 283 個,50.33%)、細(xì)胞組成(47 818 個,55.79%)和分子功能(27 375 個,31.83%)三大類共51 個功能分類。在分子功能中,催化活性(12 156 個,14.14%)和結(jié)合(11 434 個,13.30%)注釋到的Unigene 較多;在細(xì)胞組分中,細(xì)胞(9 631 個,11.20%)和細(xì)胞部分(9 607個,11.17%)注釋到的Unigene 較多;生物過程中,代謝過程(11 847 個,13.78%)和分子過程(10 948 個,12.73%)注釋最豐富。

    圖1 紅腳艾Unigene 的GO 功能分類Fig.1 Classification of GO function of Artemisia rubripes Nakai Unigene

    2.2.3 KEGG代謝通路分析 從KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果來看,16 846 個Unigene 參與到130 條代謝途徑中。其中核糖體途徑注釋的基因較豐富(824 個,4.89%),其次是碳代謝(604 個,3.59%)、剪切體(503 個,2.99%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工(474個,2.81%)和氨基酸生物合成(466 個,2.77%)等。參與類黃酮生物合成的基因有49 個,僅占0.29%。萜類作為自然界中結(jié)構(gòu)多、種類多的天然化合物,其生物合成分為前體合成、骨架構(gòu)建和后修飾3 部分。本研究獲得萜類骨架合成過程Unigene 105 個,參與直接前體GPP(Geranyl-PP)、IPP(Isopentenyl-PP)及DMAPP(Dimethylallyl-PP)的形成,參與單萜生物合成相關(guān)的Unigene 有13個,參與二萜生物合成的Unigene 有27 個,參與倍半萜和三萜生物合成相關(guān)的Unigene 有14 個,萜類經(jīng)細(xì)胞色素P450 等酶修飾后形成化合物,如二萜類化合物對腫瘤有一定治療作用,二萜類激素Gas 對植物發(fā)育具有調(diào)控作用,三萜皂苷具有很高的藥用價值等。

    2.2.4 KOG 功能分類 KOG 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果(圖2)顯示,紅腳艾26 171 個Unigene 被注釋到25個KOG 功能分類中。其中,一般功能預(yù)測的基因最多,共有5 458 個,占20.86%;其次是信號傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因(2 976 個,11.37%),翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶基因(2 862 個,10.94%),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生相關(guān)基因(1 690 個,6.46%),轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因(1 527 個,5.83%),細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(1 374個,5.25%),碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因(1 319 個,5.04%),與次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝相關(guān)基因(1 164 個,4.45%)等,細(xì)胞運(yùn)動注釋到的基因最少,僅18 個,占0.07%;未知功能的基因有1 491 個,需在后期挖掘其功能。

    圖2 紅腳艾Unigene 的KOG 功能分類Fig.2 Classification of KOG function of Artemisia rubripes Nakai Unigene

    2.2.5 COG 功能注釋 COG 數(shù)據(jù)庫功能注釋結(jié)果(圖3)形式,共有12 810 個Unigene 被注釋到25 個COG 功能分類中。其中,翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生的基因最多,有1 525 個,占11.9%;其次是一般功能預(yù)測基因(1 515 個,11.83%),翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、伴侶基因(1 287 個,10.05%),信號傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因(1 106 個,8.63%),碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因(1 098 個,8.57%)等;注釋基因最少的是RNA 加工與修飾,僅13 個,占0.1%;另有277 個Unigene 被注釋到未知功能基因,762 個Unigene 與次生代謝生物合成、運(yùn)輸和分解代謝相關(guān),占5.95%。

    圖3 紅腳艾Unigene 的COG 功能分類Fig.3 Classification of COG function of Artemisia rubripes Nakai Unigene

    2.3 SSR 分布

    利用MISA 軟件篩選得到10 00 bp 以上的紅腳艾Unigene 并進(jìn)行SSR 分析,結(jié)果(圖4)鑒定出6 種類型、3 529 個SSR 標(biāo)記。其中,單堿基重復(fù)SSR(p1)最多,共檢測到1 684 個位點;其次是三堿基重復(fù)SSR(p3)共檢測到1 017 個,雙堿基重復(fù)SSR(p2)有539 個,復(fù)合型重復(fù)SSR(c)有232 個,四堿基重復(fù)SSR(p4)有37個,五堿基重復(fù)SSR(p5)和六堿基重復(fù)SSR(p6)較少,分別為5 個和11 個。

    圖4 紅腳艾Unigene 的SSR 位點分析Fig.4 SSR sites analysis of Artemisia rubripes Nakai Unigene

    3 討論

    紅腳艾歷史上主要分布于嶺南地區(qū),惠州市的博羅縣、羅浮山及廣州市番禺區(qū)等地皆有縣志及通史記載,但近代以來對其研究與利用很少。隨著本草組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多藥用植物基因組得到解析,也使得很多資源得以利用和保護(hù)[19]。由于藥用植物基因組學(xué)研究晚于大眾作物,因此轉(zhuǎn)錄組學(xué)成了本草基因組學(xué)研究的重要手段之一。本研究借助高通量測序技術(shù)對紅腳艾轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了初步探究,共獲得7.24 Gb clean data,GC含量為44.67%,Q30堿基百分比達(dá)到92.57%以上;通過Trinity 進(jìn)行de novo 組裝,共得到173 093 個轉(zhuǎn)錄本,對組裝的轉(zhuǎn)錄本去冗余后共獲得85 991個Unigene,平均長度為616.87 bp,N50 為925 bp,說明紅腳艾的組裝質(zhì)量較好,能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求。

    通過數(shù)據(jù)庫比對,注釋到47 216 個Unigene,與向日葵(H.annuus)、萵苣(L.sativa)、洋薊(C.cardunculusvar.scolymus)等菊科植物匹配基因最多,另有45.09%的Unigene 未被注釋,可能由于蒿屬植物組學(xué)報道較少或組裝的序列較短等原因?qū)е拢?0]。在KEGG 代謝通路分析中,核糖體途徑、蛋白質(zhì)加工、氨基酸生物合成途徑注釋的基因較豐富,可能與氨基酸種類、總氨基酸含量較高有關(guān),而參與類黃酮生物合成的基因有49 個,僅占0.29%,這可能是紅腳艾側(cè)柏酮含量極低的原因。本研究結(jié)果可為紅腳艾功能基因挖掘、次級代謝物質(zhì)合成通路解析提供幫助,也可為中藥指紋圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源鑒定保存及分子輔助良種選育提供基礎(chǔ)[21]。

    SSR 分子標(biāo)記具有豐度高、共顯性和多等位性等優(yōu)點[22],可利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫資源開發(fā)SSR 引物。本研究鑒定到紅腳艾SSR 位點3 529 個,可為其分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定與優(yōu)選、分子標(biāo)記育種等奠定理論基礎(chǔ),為利用分子手段鑒定、區(qū)分紅腳艾品種及評價其質(zhì)量提供依據(jù)。

    4 結(jié)論

    本研究通過高通量測序技術(shù)獲得了紅腳艾的轉(zhuǎn)錄組信息特征,經(jīng)de novo 組裝共獲得85 991個Unigene,有47 216 個Unigene 在NR、KEGG、COG、KOG、GO 和Pfam 數(shù)據(jù)庫獲得功能注釋。KEGG 代謝通路中,有16 846 個Unigene 參與氨基酸、萜類、黃酮類等130 條代謝途徑,其中有466 個Unigene 參與氨基酸合成、49 個Unigene 參與黃酮類合成。同時在紅腳艾中還鑒定到3 529 個SSR 標(biāo)記,通過獲得的紅腳艾遺傳標(biāo)記位點分布和Unigene,可進(jìn)行SSR 引物設(shè)計,為紅腳艾種質(zhì)資源遺傳改良、分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    艾蒿堿基氨基酸
    艾蒿坪聽雪
    牡丹(2021年17期)2021-09-11 23:28:38
    梅全喜:艾蒿食療百味
    應(yīng)用思維進(jìn)階構(gòu)建模型 例談培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)造性思維
    中國科學(xué)家創(chuàng)建出新型糖基化酶堿基編輯器
    生命“字母表”迎來4名新成員
    月桂酰丙氨基酸鈉的抑菌性能研究
    生命“字母表”迎來4名新成員
    UFLC-QTRAP-MS/MS法同時測定絞股藍(lán)中11種氨基酸
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:05
    采一把艾蒿回家
    一株Nsp2蛋白自然缺失123個氨基酸的PRRSV分離和鑒定
    久久国产精品大桥未久av| 丝瓜视频免费看黄片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲中文av在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 国产免费现黄频在线看| 涩涩av久久男人的天堂| 免费黄频网站在线观看国产| 丝袜喷水一区| 国产不卡一卡二| 两个人免费观看高清视频| 久久久精品免费免费高清| 黄片小视频在线播放| 天天影视国产精品| 91老司机精品| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产福利在线免费观看视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 十八禁网站网址无遮挡| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一本综合久久免费| 亚洲av片天天在线观看| 超碰成人久久| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一区福利在线观看| 亚洲av美国av| 亚洲人成77777在线视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产福利在线免费观看视频| 两性夫妻黄色片| 欧美乱妇无乱码| 欧美一级毛片孕妇| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 真人做人爱边吃奶动态| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 超碰成人久久| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲专区中文字幕在线| 十八禁高潮呻吟视频| 好男人电影高清在线观看| av天堂在线播放| 一个人免费看片子| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 天天添夜夜摸| 精品福利永久在线观看| 日本av免费视频播放| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 久久精品国产综合久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 婷婷丁香在线五月| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 视频在线观看一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 丝袜在线中文字幕| 岛国毛片在线播放| 日韩有码中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品久久久人人做人人爽| 中亚洲国语对白在线视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 又黄又粗又硬又大视频| 成年动漫av网址| 亚洲黑人精品在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品国产亚洲在线| 免费高清在线观看日韩| 桃花免费在线播放| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人影院久久av| 国产一区二区 视频在线| 成人特级黄色片久久久久久久 | 高清av免费在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 成人国产一区最新在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 高清在线国产一区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 高清视频免费观看一区二区| 99热网站在线观看| 下体分泌物呈黄色| 国产91精品成人一区二区三区 | 波多野结衣av一区二区av| 国产伦人伦偷精品视频| 国产高清videossex| 一区二区三区激情视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲午夜理论影院| 国产又色又爽无遮挡免费看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 无人区码免费观看不卡 | 亚洲伊人色综图| 另类亚洲欧美激情| 极品教师在线免费播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 黄色a级毛片大全视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品在线美女| 国产真人三级小视频在线观看| 国产欧美亚洲国产| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美一级毛片孕妇| 午夜福利视频精品| 国产亚洲一区二区精品| 国产在线免费精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产老妇伦熟女老妇高清| 在线观看66精品国产| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文字幕av电影在线播放| 无限看片的www在线观看| 不卡一级毛片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 免费黄频网站在线观看国产| 高清视频免费观看一区二区| av网站免费在线观看视频| 首页视频小说图片口味搜索| 热99国产精品久久久久久7| 午夜福利一区二区在线看| 国产色视频综合| 国产成人免费无遮挡视频| 涩涩av久久男人的天堂| 一区二区三区精品91| 日日夜夜操网爽| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 黄色成人免费大全| 一本综合久久免费| 色视频在线一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 五月天丁香电影| 12—13女人毛片做爰片一| 日本av手机在线免费观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 乱人伦中国视频| 99re在线观看精品视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费在线观看黄色视频的| 成人精品一区二区免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产在线视频一区二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人手机av| 国产成人啪精品午夜网站| 久久 成人 亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 丁香六月天网| 成年人免费黄色播放视频| 中亚洲国语对白在线视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品一区二区三卡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩有码中文字幕| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久久久久免费视频了| 91成人精品电影| 亚洲精华国产精华精| 啦啦啦在线免费观看视频4| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费观看a级毛片全部| 黄色成人免费大全| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美精品av麻豆av| 国产又爽黄色视频| 成年人黄色毛片网站| 国产在视频线精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 在线av久久热| 大型黄色视频在线免费观看| 一区二区三区精品91| 大片免费播放器 马上看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99精品久久久久人妻精品| 女性被躁到高潮视频| 久久久久精品人妻al黑| 国产男女内射视频| 中文字幕制服av| 男女下面插进去视频免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲免费av在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产成人精品久久二区二区91| 我的亚洲天堂| 精品一品国产午夜福利视频| 一区二区av电影网| 另类精品久久| 电影成人av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99精品在免费线老司机午夜| 午夜福利欧美成人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲人成77777在线视频| 成人影院久久| 99re在线观看精品视频| 亚洲免费av在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 午夜福利一区二区在线看| 日本wwww免费看| 麻豆乱淫一区二区| 99国产综合亚洲精品| 黄片播放在线免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲成国产人片在线观看| 另类精品久久| 丝袜人妻中文字幕| 成年版毛片免费区| 免费观看人在逋| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产免费av片在线观看野外av| 两人在一起打扑克的视频| 精品国产亚洲在线| 免费看十八禁软件| 9热在线视频观看99| 露出奶头的视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品99久久99久久久不卡| videosex国产| 国产99久久九九免费精品| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产av新网站| 在线 av 中文字幕| 国产精品国产av在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 久久久欧美国产精品| 国产黄频视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一本色道久久久久久精品综合| 9191精品国产免费久久| 悠悠久久av| 成人亚洲精品一区在线观看| aaaaa片日本免费| 丝袜美足系列| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产成人精品久久二区二区91| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线 av 中文字幕| 男女无遮挡免费网站观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 最新美女视频免费是黄的| 国产亚洲一区二区精品| 日本黄色日本黄色录像| 女警被强在线播放| 又黄又粗又硬又大视频| 两个人免费观看高清视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品午夜福利视频在线观看一区 | 国产一区二区激情短视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 悠悠久久av| 免费观看av网站的网址| 多毛熟女@视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 成人免费观看视频高清| 日韩大片免费观看网站| 午夜激情av网站| 男女床上黄色一级片免费看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜91福利影院| 国产av一区二区精品久久| 一区在线观看完整版| 一本久久精品| 他把我摸到了高潮在线观看 | 日韩欧美国产一区二区入口| 国产成人精品无人区| av天堂久久9| 日韩免费av在线播放| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美日韩黄片免| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 最新的欧美精品一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美精品一区二区大全| 黄色a级毛片大全视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 视频在线观看一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| 欧美在线黄色| 久久九九热精品免费| 黄色怎么调成土黄色| 午夜免费成人在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 成年版毛片免费区| 考比视频在线观看| 男人操女人黄网站| 色综合婷婷激情| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲成人手机| 免费少妇av软件| 香蕉国产在线看| 中文字幕av电影在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av超薄肉色丝袜交足视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩欧美免费精品| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲久久久国产精品| 老司机午夜十八禁免费视频| av不卡在线播放| 岛国毛片在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 一级片'在线观看视频| 波多野结衣av一区二区av| 性少妇av在线| 在线观看人妻少妇| 大码成人一级视频| 日韩视频在线欧美| 美女扒开内裤让男人捅视频| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产真人三级小视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久亚洲精品不卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久热在线av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 青青草视频在线视频观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久99热这里只频精品6学生| 99re6热这里在线精品视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美国产精品一级二级三级| 1024香蕉在线观看| 怎么达到女性高潮| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产伦人伦偷精品视频| 曰老女人黄片| 18在线观看网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 日本av免费视频播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最黄视频免费看| 亚洲专区中文字幕在线| e午夜精品久久久久久久| 精品亚洲成国产av| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜福利一区二区在线看| 久久久精品94久久精品| 亚洲,欧美精品.| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 宅男免费午夜| 国产精品电影一区二区三区 | 一进一出抽搐动态| 免费看a级黄色片| 桃花免费在线播放| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久欧美国产精品| 久久影院123| 精品乱码久久久久久99久播| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美在线一区亚洲| 午夜福利影视在线免费观看| 91精品三级在线观看| 多毛熟女@视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91精品三级在线观看| 人人妻人人澡人人看| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 午夜老司机福利片| 亚洲专区字幕在线| 国产精品二区激情视频| 99热国产这里只有精品6| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 成年人免费黄色播放视频| 99国产精品99久久久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲一区中文字幕在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜精品国产一区二区电影| av片东京热男人的天堂| avwww免费| 免费av中文字幕在线| 国产不卡av网站在线观看| 午夜免费成人在线视频| 免费av中文字幕在线| 国产精品 欧美亚洲| bbb黄色大片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 91大片在线观看| 欧美成人午夜精品| 午夜福利一区二区在线看| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 极品教师在线免费播放| 日韩欧美免费精品| 女警被强在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲第一av免费看| 在线看a的网站| 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日本中文国产一区发布| 性少妇av在线| 欧美日韩av久久| 亚洲久久久国产精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日日爽夜夜爽网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 最近最新免费中文字幕在线| 一级毛片女人18水好多| 国产在线一区二区三区精| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 天天操日日干夜夜撸| 91大片在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 操美女的视频在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产av国产精品国产| 欧美黄色片欧美黄色片| svipshipincom国产片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 天堂中文最新版在线下载| 99精品在免费线老司机午夜| a级片在线免费高清观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产成+人综合+亚洲专区| 国产一卡二卡三卡精品| 黄色片一级片一级黄色片| 手机成人av网站| 亚洲久久久国产精品| 午夜久久久在线观看| 激情视频va一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 丁香六月天网| 69精品国产乱码久久久| 久热爱精品视频在线9| av网站免费在线观看视频| 国产精品久久久久成人av| 国产成人精品在线电影| 色视频在线一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 色精品久久人妻99蜜桃| 一本综合久久免费| 在线天堂中文资源库| 国产精品一区二区在线不卡| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 男人操女人黄网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲全国av大片| 青草久久国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天天操日日干夜夜撸| 高清欧美精品videossex| 黄色视频不卡| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线永久观看黄色视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美黑人精品巨大| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 老汉色∧v一级毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产精品电影一区二区三区 | 黄色视频不卡| 国产精品一区二区在线不卡| 国产高清激情床上av| 亚洲免费av在线视频| 免费在线观看影片大全网站| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲av成人一区二区三| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜久久久在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 视频区图区小说| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产在线一区二区三区精| 男人操女人黄网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 伦理电影免费视频| 精品人妻1区二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 又紧又爽又黄一区二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 大片免费播放器 马上看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 久久久久精品人妻al黑| av天堂久久9| 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产欧美在线一区| 97在线人人人人妻| 美女主播在线视频| 久热爱精品视频在线9| 久久精品国产亚洲av高清一级| 啦啦啦视频在线资源免费观看| kizo精华| 老司机福利观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产av又大| 在线观看66精品国产| 亚洲av日韩在线播放| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久中文看片网| 免费av中文字幕在线| 国产又爽黄色视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 12—13女人毛片做爰片一| 免费看十八禁软件| 美女国产高潮福利片在线看| 黄色视频,在线免费观看| 丁香六月欧美| 国产在线视频一区二区| 搡老乐熟女国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 狂野欧美激情性xxxx| 国产男靠女视频免费网站| e午夜精品久久久久久久| 亚洲 国产 在线| av福利片在线| 不卡一级毛片| 成年人黄色毛片网站| 亚洲五月色婷婷综合| 丝袜人妻中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 在线 av 中文字幕| 日本a在线网址| 一本大道久久a久久精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丰满少妇做爰视频| 午夜福利免费观看在线| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久网色| 夜夜爽天天搞| 国产精品免费视频内射| 欧美乱妇无乱码| 超碰97精品在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| a级毛片在线看网站| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品 国内视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人国产一区最新在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产男靠女视频免费网站| 狂野欧美激情性xxxx| 精品视频人人做人人爽| 欧美国产精品一级二级三级| 人妻 亚洲 视频| 脱女人内裤的视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 交换朋友夫妻互换小说| 蜜桃国产av成人99|