煙草種質(zhì)資源重要活性成分含量差異研究

邵秀紅，馬柱文，袁清華，李集勤，潘曉英，黃振瑞

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省煙草育種與綜合利用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640）

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacumL.）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，作為卷煙工業(yè)原料的同時(shí)，其藥用價(jià)值備受關(guān)注。煙草中含有綠原酸、蘆丁（亦稱蕓香苷）、茄尼醇等多種活性成分，其中綠原酸具有抗肺炎鏈球菌、金葡球菌和痢疾志賀氏菌等細(xì)菌，抗艾滋病、甲型流感、乙型肝炎等病毒，抗肝癌、肺癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤，治療血脂異常、糖尿病、高血壓等代謝性疾病等多種藥理作用［1-2］；蘆丁可以有效清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒、拮抗血小板活化因子、抗急性胰腺炎等；茄尼醇是合成輔酶Q10 和維生素K2 的主要中間體，還可以作為抗?jié)兯幬?、抗癌藥物的合成原料?-4］。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所于20 世紀(jì)50 年代開始煙草種質(zhì)資源的收集工作，目前保存各類煙草資源約1 300份，其中包括廣東地方特有資源300 多份，這些煙草資源在本地保存后綠原酸、蘆丁、茄尼醇等重要活性成分的含量變化尚不清晰。因此，明確各活性成分的含量差異，對于開發(fā)利用這些煙草資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】綠原酸和蘆丁都是多酚類化合物，在煙草中的含量較高，占煙草中植物多酚含量的80%以上［5］。植物中廣泛存在的綠原酸類物質(zhì)有6 種異構(gòu)體，即綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C，這些異構(gòu)體都具有一定的生物活性［6］。史春云等［7］測定了不同產(chǎn)地上部煙葉中8 種多酚物質(zhì)的含量，結(jié)果表明煙葉中含量較高的是綠原酸和蕓香苷，且不同產(chǎn)地的多酚含量差異較大，其中以河南襄縣的綠原酸含量最高。李力等［8］分析了不同來源的18 個(gè)烤煙樣品中6 種多酚的含量，發(fā)現(xiàn)從高到低依次為綠原酸、蕓香苷、隱綠原酸、新綠原酸、莰菲醇基-3-蕓香糖苷、莨菪亭。萬誠等［9］的研究結(jié)果顯示，在煙草整個(gè)生育期，煙葉中綠原酸呈4 種變化趨勢，分別為上升、上升—下降—上升、“M”和“W”型變化趨勢；其中在煙葉成熟采收時(shí)，烤煙類與香料煙類品種的綠原酸含量最高、為2.3%，其次是晾曬煙，白肋煙最低、為1.4%。這些研究表明，在不同產(chǎn)地、不同類型、不同生育期的煙草中，綠原酸、蘆丁等的含量有較大差異。茄尼醇是一種萜烯類化合物，在煙葉、馬鈴薯葉和桑葉中含量突出，尤其在煙葉中茄尼醇含量可高達(dá)0.3%～3%［10］。Kotipalli 等［11］對茄科植物中提取的茄尼醇進(jìn)行測定，證實(shí)了煙草是茄尼醇最豐富的來源（0.85%～3.75%）。劉宇欣等［12］的研究表明，白肋煙及烤煙中茄尼醇含量較高，香料煙其次，而雪茄煙含量最低。同一類型煙草品種在不同的取樣時(shí)期，茄尼醇的含量均以葉中最高，其次是莖，根中最低［13］，且煙草不同葉位茄尼醇含量的順序?yàn)樯喜咳~＞中部葉＞下部葉［14-15］。不同生長期的云煙85 和漂河1 號(hào)煙葉中茄尼醇含量隨著煙株苗齡的增加而逐漸上升，現(xiàn)蕾時(shí)葉中的茄尼醇含量達(dá)到最大值，此后逐漸下降，并趨于平緩［16］。也有一些關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)煙草茄尼醇含量變化的報(bào)道［12,15,17-18］。以上研究表明，茄尼醇在煙草中的含量最高，不同類型、不同組織、不同葉位、不同生育期以及不同產(chǎn)區(qū)的煙草中，茄尼醇的含量也有較大差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所目前保存煙草種質(zhì)資源約1 300 份，是我國煙草資源的主要保存單位［19］，由于煙草資源主要以種子形態(tài)在特定環(huán)境中進(jìn)行保存，一定時(shí)間后種子發(fā)芽率逐漸下降，因此需要按計(jì)劃分年度進(jìn)行繁種更新，以保證煙草種質(zhì)的長期保存［20］。繁種用煙草種質(zhì)資源中各活性成分含量亟需明確，而前人的研究多是檢測打頂后煙草各成分的含量［21-23］，不打頂條件下含量變化尚未見相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用HPLC方法檢測繁種用煙草種質(zhì)資源中綠原酸、蘆丁、茄尼醇等重要活性成分的含量，以期為所保存煙草種質(zhì)資源的有效開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地進(jìn)行，試驗(yàn)地肥力中等，前作為水稻。供試17 份煙草種質(zhì)資源材料包括K326、云煙87、翠碧一號(hào)、廣 煙125、廣 煙127、NC82、NC347、CV099、SR1307、黃 坑7 號(hào)-1、黃坑片坑3 號(hào)等11 份烤煙和S20 大牛舌、S19 大肩葉、S18 大幅煙、S21 大秋根-2、S17 大都青梗、S16 打賓柳葉煙等6 份曬煙，于2020 年7 月10 日播種育苗，9月1 日移栽，采用大田常規(guī)栽培管理，煙株現(xiàn)蕾后不打頂，在葉片成熟期采收上二棚葉片，每份資源采收3 株，每株采1～2 片葉，105 ℃殺青30 min，然后去掉各葉片的主脈，再于55 ℃烘箱中烘干備用。

儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國），超聲波清洗器（KQ-250DE，江蘇昆山），電子天平（Mettler Toledo EL204，德國），高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific SL16R，美國），超純水器（Millipore Direct-Q，美國），多功能粉碎機(jī)（FW100，天津）。

試劑：甲醇、乙醇、乙腈、甲酸和磷酸二氫鈉均為Sigma Aldrich 品牌，HPLC 級(jí)別。綠原酸（Chlorogenic acid）、新綠原酸（Neochlorogenic acid）、隱綠原酸（Cryptochlorogenic acid）、異綠原酸A（Isochlorogenic acid A）、異綠原酸B（Isochlorogenic acid B）、異綠原酸C（Isochlorogenic acid C）、蘆丁（Rutin）和茄尼醇（Solanesol）等分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥98 %，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 分別精確稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別定容于200 mL 容量瓶中，配制成50 μg/mL 的母液，然后等梯度分別稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定分析曲線。

準(zhǔn)確稱量蘆丁和茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別定容于10 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的母液，然后等梯度分別稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定分析曲線。

1.2.2 樣品制備 將烘干的煙葉用多功能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過孔徑0.425 mm 篩備用。稱取0.1 g左右的煙末樣品于2 mL 離心管，加入1.0 mL 提取液，在30 ℃、超聲提取20 min，重復(fù)3 次；浸提液以10 000 r/min 離心10 min，將上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，然后將稀釋后的樣品進(jìn)行HPLC分析。6種綠原酸異構(gòu)體的提取液為50%的甲醇，蘆丁和茄尼醇的提取液為純甲醇。

1.2.3 HPLC 分析 色譜條件：色譜柱為VPODS（Shim-pack，5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫為35 ℃，紫外檢測器為Agilent 1260 VWD。

（1）6 種綠原酸異構(gòu)體的測定。流動(dòng)相A（0.1%甲酸）：B（乙腈），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，檢測波長327 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Progress of gradient elution

（2）蘆丁的測定。流動(dòng)相A（0.1%磷酸二氫鈉）：B（乙腈）=68:32，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，檢測波長275 nm。

（3）茄尼醇的測定。流動(dòng)相A（乙醇）：B（甲醇）=72:28，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，檢測波長215 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件確定

為了準(zhǔn)確區(qū)分6 種綠原酸異構(gòu)體，利用HPLC 法進(jìn)行檢測，并參照董珊等［24］的方法，以0.1%甲酸和乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，利用1260 VWD 檢測器，檢測波長選擇327 nm，6 種化合物可得到良好的分離（圖1）。蘆丁的檢測以0.1%磷酸二氫鈉和乙腈為流動(dòng)相，檢測波長選擇275 nm。茄尼醇檢測的流動(dòng)相是乙醇和甲醇，檢測波長為215 nm。柱溫選擇35 ℃，該溫度下8種化合物的分離效果良好。

2.2 線性關(guān)系分析

以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果（表2）顯示，6 種綠原酸異構(gòu)體在12.5～0.40 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為1.1～1.5 mg/kg，定量限為3.7～5.0 mg/kg；蘆丁、茄尼醇分別在1.0～0.03125、0.5～0.03125 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。圖1～圖3 分別為6 種綠原酸異構(gòu)體、蘆丁和茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖，其中6 種綠原酸異構(gòu)體的保留時(shí)間為7.637～17.468 min，蘆丁、茄尼醇的保留時(shí)間分別為7.289 和7.370 min。

圖1 6 種綠原酸異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of six chlorogenic acid isomer standards

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of rutin standard

圖3 茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of solanesol standard

表2 8 種化合物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and correlation coefficients of 8 compounds

2.3 6 種綠原酸異構(gòu)體含量分析

從圖4 可以看出，6 種綠原酸異構(gòu)體中，新綠原酸以S16 打賓柳葉煙的含量最高（215.91 mg/kg），其次是NC347、NC82（分別為189.96、162.18 mg/kg），而K326 最低（未檢測到）；含量高于100 mg/kg 的種質(zhì)有8 份，其中烤煙和曬煙種質(zhì)各4 份，分別占所測種質(zhì)的36.4%和66.7%。綠原酸的含量如圖5 所示，以S16 打賓柳葉煙最高（4 813.41 mg/kg），其次是S20 大牛舌、S19 大肩葉（分別為2 475.67、2 081.68 mg/kg），而K326 最低（47.43 mg/kg）；含量高于1 000 mg/kg 的種質(zhì)有9 份，其中烤煙5 份，曬煙4 份，分別占所測種質(zhì)的45.5%和66.7%。隱綠原酸的含量如圖6 所示，也是以S16 打賓柳葉煙最高（670.13 mg/kg），其次是S19 大肩葉、S20 大牛舌（分別為425.63、311.53 mg/kg），而K326 最低（未檢測到）；含量高于200 mg/kg 的種質(zhì)有9 份，其中烤煙5 份，曬煙4 份，分別占所測種質(zhì)的45.5%和66.7%。以上結(jié)果表明，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸含量較高的曬煙類煙草種質(zhì)數(shù)占比均較高，烤煙類不同煙草種質(zhì)中這3 種活性成分的含量差異較大。

圖4 17 份煙草種質(zhì)的新綠原酸含量Fig.4 Content of neochlorogenic acid in 17 tobacco germplasms

圖5 17 份煙草種質(zhì)的綠原酸含量Fig.5 Content of chlorogenic acid in 17 tobacco germplasms

圖6 17 份煙草種質(zhì)的隱綠原酸含量Fig.6 Content of cryptochlorogenic acid in 17 tobacco germplasms

異綠原酸B的含量如圖7所示，在8份煙草種質(zhì)中檢測到，均為烤煙，占所測種質(zhì)的72.7%，以廣煙127的含量最高（108.68 mg/kg），其次是NC82、K326，均低于100 mg/kg，另外9份種質(zhì)中未檢測到，其中包括3份烤煙和6份曬煙；異綠原酸A的含量如圖8所示，17份煙草種質(zhì)的含量均低于10 mg/kg，其中以NC82最高（9.89 mg/kg），其次是NC347、S21大秋根-2，除廣煙125和黃坑7號(hào)-1烤煙種質(zhì)中未檢測到外，全部曬煙以及9份烤煙種質(zhì)中均有檢測到；異綠原酸C的含量如圖9所示，17份煙草種質(zhì)的含量均低于20 mg/kg，以廣煙127含量最高（19.80 mg/kg），其次是CV099、S20 大牛舌，全部曬煙以及9份烤煙種質(zhì)中均有檢測到，與異綠原酸A相似，只有廣煙125和黃坑7號(hào)-1烤煙種質(zhì)中未檢測到。以上結(jié)果表明，異綠原酸B在所選6份曬煙煙草種質(zhì)中均未檢測到，廣煙125和黃坑7號(hào)-1烤煙中均未檢測到異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C，17份煙草種質(zhì)中這3種活性成分的含量與前3種相比，大多較低。

圖7 17 份煙草種質(zhì)的異綠原酸B 含量Fig.7 Content of isochlorogenic acid B in 17 tobacco germplasms

圖8 17 份煙草種質(zhì)的異綠原酸A 含量Fig.8 Content of isochlorogenic acid A in 17 tobacco germplasms

圖9 17 份煙草種質(zhì)的異綠原酸C 含量Fig.9 Content of isochlorogenic acid C in 17 tobacco germplasms

綜上可以看出，綠原酸是6 種異構(gòu)體中含量最高的，在17 份煙草種質(zhì)中均有檢測到，其次是隱綠原酸和新綠原酸，而異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 的含量總體偏低，其中異綠原酸A 和異綠原酸C 在15 份種質(zhì)中均有檢測到，異綠原酸B 在多數(shù)烤煙種質(zhì)中檢測到，但在全部曬煙中均未檢測到。

2.4 蘆丁含量分析

如圖10 所示，蘆丁以NC347 烤煙的含量最高（46.456 g/kg），其次是S19 大肩葉（7.782 g/kg）和S17 大都青梗曬煙（6.250 g/kg），而云煙87 烤煙最低（1.206 g/kg）；含量高于3 g/kg的烤煙和曬煙種質(zhì)分別有3 份和6 份，分別占27.3%和100%?？梢姡煌緹煼N質(zhì)中蘆丁的含量差異較大，含量范圍為1.206～46.456 g/kg，而不同曬煙種質(zhì)中蘆丁的含量差異比烤煙稍小，為3.269～7.782 g/kg。

圖10 17 份煙草種質(zhì)的蘆丁含量Fig.10 Content of rutin in 17 tobacco germplasms

2.5 茄尼醇含量分析

如圖11 所示，茄尼醇以NC347 烤煙中的含量最高（44.913 g/kg），其次是K326 烤煙（11.140 g/kg）、S17 大都青梗曬煙（9.844 g/kg），而黃坑7 號(hào)-1 烤煙中最低（2.793 g/kg）。含量高于3 g/kg 的烤煙和曬煙種質(zhì)分別有9 份和5 份，分別占所測資源的81.8%和83.3%?？梢姡煌緹煼N質(zhì)中茄尼醇的含量差異較大，含量范圍為2.793～44.913 g/kg，而不同曬煙資源中茄尼醇的含量差異也相對較小，為2.857～9.844 g/kg。

圖11 17 份煙草種質(zhì)的茄尼醇含量Fig.11 Content of solanesol in 17 tobacco germplasms

3 討論

3.1 綠原酸、蘆丁的含量差異

綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸生成的縮酚酸，在6 種綠原酸異構(gòu)體中，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸均為單咖啡酰奎寧酸，異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 均為二咖啡?？鼘幩帷einhart 等［25］分析了巴西100 種商業(yè)化種植植物中6 種綠原酸異構(gòu)體的含量，其中綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分別在66、63、52 種植物中檢測出，而異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 分別在55、48、48 種植物中檢測出。該研究表明，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸在多數(shù)植物中都能檢測到，但也有多種植物檢測不到異綠原酸B 和異綠原酸C，與本研究結(jié)果相似。在咖啡中，3 種單咖啡?？鼘幩岬臐舛认鄬^高［26］，單咖啡?？鼘幩峒s占生咖啡豆質(zhì)量的10%［27］，其中以綠原酸的含量最為豐富［6］?？Х群徒疸y花是綠原酸異構(gòu)體含量均較高的兩種植物。董珊等［24］的研究表明，咖啡和金銀花中6 種綠原酸異構(gòu)體的含量均相對較高，其中金銀花以綠原酸含量最高、為1.94×104mg/kg，其次是異綠原酸A 和異綠原酸C，分別為6.42×103、2.00×103mg/kg；咖啡中綠原酸和隱綠原酸含量接近，分別為8.34×103和8.48×103mg/kg，其次是新綠原酸、為4.99×103mg/kg。馬躍新等［28］發(fā)現(xiàn)滇金銀花中綠原酸含量為24.79～34.01 mg/g。在煙草中，綠原酸含量與煙草的香氣密切相關(guān)，因而與煙草及其制品的等級(jí)呈正相關(guān)，綠原酸含量高的煙葉及卷煙質(zhì)量越好；綠原酸還對煙草的生長發(fā)育、煙葉顏色以及煙株抗病蟲害、抗寒及其他逆境等方面有著重要影響［9,29］。歐陽璐斯等［30］研究發(fā)現(xiàn)，煙草中14種多酚類化合物的含量差異較大，以綠原酸的含量最高、為3 828.3～9 251.6 mg/kg，新綠原酸、隱綠原酸含量分別為794.8～1 628.9、1 215.7～2 505.2 mg/kg。本研究結(jié)果表明，綠原酸在其6 種異構(gòu)體中含量最高，這與史春云等［7］、李力等［8］、Maga?a 等［6］、歐陽璐斯等［30］的研究結(jié)果一致；其次是隱綠原酸和新綠原酸，與李力等［8］的研究結(jié)果一致。本研究中，17 份煙草種質(zhì)中K326 烤煙的綠原酸含量最低，這與萬誠等［9］的研究結(jié)果即烤煙類型品種K326 的綠原酸含量最高（28.544 mg/g）相差較大，這種差異可能主要與各煙草種質(zhì)在現(xiàn)蕾后未打頂有關(guān)，煙草在現(xiàn)蕾后轉(zhuǎn)入生殖生長，消耗較多的營養(yǎng)，造成煙葉品質(zhì)下降，而綠原酸含量與改善煙葉等級(jí)密切相關(guān)［31］。

蘆丁和綠原酸同屬于多酚類化合物，前人的研究中通常同時(shí)檢測兩種化合物。史春云等［7］、李力等［8］和歐陽璐斯等［30］的研究結(jié)果顯示，煙草多酚類物質(zhì)中，蘆丁的含量僅次于綠原酸，含量范圍分別為5.73～14.88、2.61～7.87、2 825.9～6 412.6 mg/kg。本研究中，NC347 烤煙中蘆丁的含量最高，比史春云等［7］報(bào)道的最高含量高約32 g/kg，其他16 份煙草種質(zhì)的含量范圍與歐陽璐斯等［30］和李力等［8］的結(jié)果趨于一致。然而，本研究中蘆丁與綠原酸的含量相比整體偏高，這與前人研究報(bào)道有較大差異。也有其他作物中蘆丁含量比較高的報(bào)道，如Vollmannová 等［32］研究了不同蕎麥品種葉片中蘆丁、牡荊素、槲皮素、山奈酚等化合物的含量，其中蘆丁的含量最高，為17.742～31.069 mg/g，含量最高的蕎麥品種Kasho-2 與NC347 烤煙較接近。

3.2 茄尼醇的含量差異

茄尼醇是煙草石油醚、環(huán)己烷提取物的主要組成成分。煙草石油醚、環(huán)己烷提取物被認(rèn)為是煙草香氣成分的重要來源，也是煙氣有害成分的貢獻(xiàn)者，是煙葉質(zhì)量評價(jià)的主要指標(biāo)［15］。根據(jù)前人的研究報(bào)道，煙草中茄尼醇的含量為0.3%～4.13%［10-11,18］。本研究中，NC347 烤煙中茄尼醇的含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.49%，比前人報(bào)道的4.13%高0.36%，該種質(zhì)在資源鑒評方面值得深入研究；其他16 份煙草種質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.28%～1.11%，與前人的結(jié)果基本一致。本研究11 份烤煙和6 份曬煙種質(zhì)中，茄尼醇含量高于5 g/kg 的分別有6 份和3 份，說明所測烤煙類種質(zhì)的茄尼醇含量較高，與劉宇欣等［12］的結(jié)果類似，而且與所測種質(zhì)綠原酸的含量相比也整體偏高。

4 結(jié)論

本研究17 份繁種用煙草種質(zhì)資源中，蘆丁和茄尼醇的含量與綠原酸相比總體較高，且均以NC347 烤煙的含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.65%和4.49%，該種質(zhì)值得進(jìn)一步研究，可以作為蘆丁和茄尼醇開發(fā)利用的候選種質(zhì)。綠原酸在其6種異構(gòu)體中含量最高，且以S16 打賓柳葉煙曬煙最高、為0.48 %，但17 份煙草種質(zhì)的綠原酸含量與前人報(bào)道的結(jié)果相差較大，由于這些種質(zhì)在現(xiàn)蕾后未打頂，可能對綠原酸有較大的影響，下一步需要明確打頂與不打頂條件下各種質(zhì)中綠原酸的差異。