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    茉莉酸對馬鈴薯苗期低溫脅迫耐性的影響

    2022-01-24 08:55:20劉計濤王夢詩索海翠羅煥明李成晨單建偉廖永珊李小波
    廣東農(nóng)業(yè)科學 2021年12期
    關鍵詞:抗寒性活性氧過氧化氫

    劉計濤,王夢詩,索海翠,羅煥明,王 麗,李成晨,單建偉,廖永珊,李小波

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室,廣東 廣州 510640)

    【研究意義】馬鈴薯(Solanum tuberosum)是我國重要的糧菜兼用作物,總產(chǎn)量和種植面積均居世界首位,在保證國家糧食安全和蔬菜周年供應中發(fā)揮重要作用,是高效農(nóng)業(yè)的重要組成部分。馬鈴薯為喜冷涼不耐低溫作物,容易遭受冬春季自然寒害,嚴重影響產(chǎn)量。茉莉酸是重要的植物激素之一,在調(diào)節(jié)非生物脅迫和生物脅迫中發(fā)揮了重要的功能,但關于茉莉酸影響馬鈴薯抗寒性的研究還較少,因此,探索茉莉酸對馬鈴薯低溫脅迫耐性的影響,有助于解析馬鈴薯抗寒生理機制,并為其在生產(chǎn)中推廣應用提供參考?!厩叭搜芯窟M展】低溫脅迫是威脅溫帶和熱帶植物的主要環(huán)境因素之一[1],會導致植物中活性氧(ROS)過度積累造成核酸、蛋白質和脂質等大分子物質的氧化損傷,最終破壞細胞功能,造成植物死亡[2][3]。茉莉酸(JA)是一種重要的植物激素,其參與調(diào)節(jié)許多生理進程,如根抑制[4]、花青素積累[5]、毛狀體形成[6]、雄性發(fā)育[7-8]、葉片衰老[9-11]、生物和非生物脅迫響應等[12-16]。前人的研究表明,外源處理MeJA 能夠顯著提升模式植物擬南芥在非冷馴化條件下的抗寒性[17],以及冷脅迫下水稻幼苗的存活率[18],在番茄中JA 能夠促進腐胺的合成降低氧化脅迫提高低溫脅迫耐性[19]。外源JA 處理能夠通過緩解氧化脅迫,維持細胞穩(wěn)態(tài)和提高抗氧化能力增強紫蘇、顛茄、小麥的抗寒性[20-22]。ICE(Inducer of CBF expression)—CBF 轉錄調(diào)節(jié)模塊在植物低溫脅迫響應中起著重要的作用[23],在擬南芥中低溫脅迫能夠激活ICE-CBF 蛋白誘導大量的COR(Coldregulated)基因的表達,最終提升擬南芥的低溫脅迫耐性[24]。有研究報道,JA 能夠正調(diào)節(jié)ICE-CBF 通路,增強擬南芥的低溫脅迫耐性[17]。這些研究表明,JA 在調(diào)節(jié)植物低溫脅迫耐性中發(fā)揮重要的功能。在馬鈴薯中,前人的研究發(fā)現(xiàn)JA能夠提升馬鈴薯對晚疫病的抗性[25],影響塊莖發(fā)育等[26],而關于JA 調(diào)節(jié)馬鈴薯抗寒性的研究還較少。因此,探索JA 調(diào)節(jié)馬鈴薯抗寒的機制對于馬鈴薯抗寒育種和栽培具有重要意義?!颈狙芯壳腥朦c】以馬鈴薯冬作區(qū)主栽品種費烏瑞它為研究對象,針對冬作區(qū)寒害頻發(fā)嚴重影響產(chǎn)量這一現(xiàn)狀,以及農(nóng)民對馬鈴薯抗寒栽培技術和品種的需求,利用外源JA 處理并通過酶活性分析和抗寒相關基因CBF的表達模式確定馬鈴薯最適JA 使用濃度?!緮M解決的關鍵問題】探討JA 調(diào)節(jié)馬鈴薯低溫脅迫耐性的最適濃度,以及其對馬鈴薯活性氧及其清除酶的影響,揭示JA 影響馬鈴薯抗寒性的生理特性。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試馬鈴薯品種為費烏瑞它,種薯購自天津市天興佳業(yè)科技有限公司,保存于冷庫中,試驗前放置于室內(nèi)待種薯發(fā)芽后切塊,在實驗室光照培養(yǎng)室進行盆栽;供試盆規(guī)格為盆底直徑22 cm,高25 cm,盆口直徑30 cm;基質為草炭土混合珍珠巖比例為2∶1。

    茉莉酸購自上海麥克林生化科技有限公司,用適量無水乙醇徹底溶解后,再緩慢加入水定容至0.1 mol/L作為母液,然后根據(jù)試驗所需濃度(50、100、200、400 μmol/L)進行稀釋定容,以去離子水作對照。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 樣品處理與采集 試驗于2021 年9 月11日在廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室進行,馬鈴薯出苗2 周的盆栽苗,每盆保留1~2 棵長勢一致的幼苗,繼續(xù)在長日照(光照16 h)條件下培養(yǎng)2 周后備用。選取25 盆長勢一致的馬鈴薯盆栽苗平均分為5 組,每組5 個生物學重復,分別用50、100、200、400 μmol/L 茉莉酸和去離子水噴施葉片,24 h 后放入低溫光照培養(yǎng)箱(達斯卡特DGZC-P1000B),以-2 ℃低溫脅迫處理5 h,分別選取處理0、5 h 頂部生長第3~4 片功能葉置于液氮中,用于下一步分析。

    1.2.2 測定項目及方法 過氧化氫含量:采用過氧化氫含量檢測試劑盒(BC3590,北京索寶萊科技有限公司),將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末,稱取0.1 g 加入1 mL 丙酮提取液并迅速渦旋震蕩混勻,并置于冰上10 min 充分反應,4 ℃、8 000 g 離心10 min,取全部上清液,置冰上待測,然后參照試劑盒測定方法,用分光光度計進行測定,調(diào)整波長至415 nm,記錄吸光值,蒸餾水調(diào)零。計算公式為:

    H2O2(μmol/g )=ΔA測定÷ΔA標準÷W

    式中,ΔA測定=A測定管-A空白管,ΔA標準=A標準管-A空白管,A 為波長415 nm 處吸光度OD415,W 為樣品質量(g)。

    馬鈴薯過氧化氫酶(CAT)活性:采用過氧化氫酶活性檢測試劑盒(BC0200,北京索寶萊科技有限公司),將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末,稱取0.1 g 樣本加入1 mL 提取液并迅速渦旋震蕩混勻,并置于冰上10 min,4 ℃、8 000 g 離心10 min,取全部上清液,置冰上待測,然后參照試劑盒測定方法,用分光光度計進行測定,調(diào)整波長至240 nm,記錄吸光值,蒸餾水調(diào)零。取1 mL CAT 檢測工作液于1 mL 石英比色皿中,再加入35 μL 酶提取液,混勻5 s,室溫下立即測定240 nm 下的初始吸光值A1 和1 min 后的吸光值A2。

    CAT 活性(U/g )=678×ΔA÷W

    式中,ΔA=A1-A2,A 為波長240 nm 處吸光度OD240,W 為樣品質量(g)。

    馬鈴薯過氧化物酶(POD)活性:采用過氧化物酶活性檢測試劑盒(BC0090,北京索寶萊科技有限公司),將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末,稱取0.1 g 樣本加入1 mL 提取液并迅速渦旋震蕩混勻,并置于冰上10 min,4 ℃、8 000 g 離心10 min,取全部上清液,置冰上待測,然后參照試劑盒測定方法,用分光光度計進行測定,調(diào)整波長至470 nm,記錄吸光值,蒸餾水調(diào)零。在1 mL 玻璃比色皿中按順序加入試劑盒試劑,立即混勻并計時,記錄470 nm 下30 s 的吸光值A1 和90 s 后的吸光值A2。

    POD 活性(U/g )=7133×ΔA÷W,ΔA=A2-A1

    超氧化物歧化酶(SOD)活性:采用超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒(BC0170,北京索寶萊科技有限公司),將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末,稱取0.1 g 樣本加入1 mL 提取液并迅速渦旋震蕩混勻,并置于冰上10 min,4 ℃、8 000 g離心10 min,取全部上清液,置冰上待測,然后參照試劑盒測定方法,加入測定試劑后充分混勻,37 ℃水浴30 min 后,置于1 mL 玻璃比色皿測定560 nm 下的吸光度,蒸餾水調(diào)零。

    式中,ΔA測定=A測定-A對照,ΔA空白=A1空白-A2空白,A 為波長560 nm 處吸光度OD560,W 為樣品質量(g)。

    1.2.3 基因表達分析 分別在Solanaceae Genomics Resource網(wǎng)站(www.spuddb.uga.edu/index.shtml)數(shù)據(jù)庫獲得MYC2和CBF1-3的序列,利用NCBI Primer Blast進行引物設計(表1)和特異性比對分析。以JA處理馬鈴薯葉片提取的RNA,利用反轉錄試劑盒(擎科,Code No.TSK302M)得到cDNA模板,采用2×TSINGKE?Master qPCR Mix(SYBR Green I with UDG)(擎科,Code No.TSE203)進行實時熒光定量(QRT-PCR)分析,ef1a作為內(nèi)參基因,獲得不同基因的相對表達量,數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。每個樣品3次生物學重復,3次技術重復。

    表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

    2 結果與分析

    2.1 JA 對馬鈴薯活性氧含量的影響

    由圖1 可知,JA 處理24 h 后馬鈴薯葉片過氧化氫的含量隨著JA 濃度的增加顯著降低,對照過氧化氫含量最高為0.856 μmol/g,其中50 μmol/L JA 處理過氧化氫含量略有降低但不顯著,100 μmol/L JA 處理后開始顯著降低,以200 μmol/L JA處理后達到最低點0.275 μmol/g,400 μmol/L JA處理比200 μmol/L JA 處理略有升高但均比對照顯著降低;經(jīng)低溫脅迫4 h 后,與低溫脅迫前相比過氧化氫含量均顯著升高,且趨勢與低溫脅迫前一致,其中對照的過氧化氫含量仍是最高、為2.176 μmol/g,200 μmol/L JA 處理最低、為1.139μmol/g。這表明JA 濃度為200 μmol/L 的處理效果最好,其次為400 μmol/L。

    圖1 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下過氧化氫含量的影響Fig.1 Effects of different JA concentrations on hydrogen peroxide content under cold stress

    2.2 JA 對活性氧清除酶活性的影響

    2.2.1 過氧化氫酶(CAT)活性 由圖2 可知,JA 處理24 h 后,馬鈴薯葉片CAT 活性總體隨著JA 濃度增加而增強,與蒸餾水對照相比,50 μmol/L JA 處理4 h 后CAT 活性由163.01 μmol/g 增加至325.07 μmol/g,顯著增強1.99 倍,100、200、400 μmol/L JA 處理的CAT 活性比50 μmol/L JA 處理略有升高但不顯著,分別為對照的2.16、2.31、2.33 倍;低溫脅迫4 h 后,與脅迫前(0h)相比,蒸餾水對照的CAT 活性由163.01 μmol/g 增加至328.13 μmol/g,顯著增強2.01 倍,而50 μmol/L JA 處理的CAT 活性變化不明顯,但100、200、400 μmol/L JA 處理的CAT 活性顯著增強,分別為367.83、426.56、455.76 μmol/g,為對照的1.12、1.30、1.39 倍。表明200 μmol/L JA 處理效果最好,其次為100、400 μmol/L JA 處理。

    圖2 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下CAT 活性的影響Fig.2 Effects of different JA concentrations on CAT activity under cold stress

    2.2.2 過氧化物酶(POD)活性 如圖3 所示,與蒸餾水對照相比,50 μmol/L JA 處理24 h 后,馬鈴薯葉片POD 活性變化不顯著;當JA 濃度增加至100 μmol/L 時,POD 活性由89.59 U/g 顯著增加至171.73 U/g,為對照的1.3 倍;JA 濃度繼續(xù)增加至200、400 μmol/L 時,POD 活性分別為對照的2 倍(181.24 U/g)和2.1 倍(195.05 U/g)。低溫脅迫4 h 后POD 活性比0 h 顯著增強,與蒸餾水對照相比,50 μmol/L JA 處理的POD 活性略有增強但不顯著;JA 濃度增加至100 μmol/L 時,POD 活性比對照增強1.81 倍;200 μmol/L JA 處理的POD 活性顯著提升,為對照的2.53 倍;400 μmol/L JA 處理與200 μmol/L JA 處理效果相似,為對照的2.63 倍。表明低溫脅迫400 μmol/L JA處理的POD 活性最強,其次為200、100 μmol/L JA 處理。

    圖3 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下POD 活性的影響Fig.3 Effects of different JA concentrations on POD activity under cold stress

    2.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性 如圖4 所示,將馬鈴薯植株進行JA 處理24 h 后,與蒸餾水對照(SOD 活性為166.32 U/g)相比,50 μmol/L JA 處理的SOD 活性(151.52 U/g)沒有發(fā)生顯著變化,而100 μmol/L JA 處理后SOD 活性(108.61 U/g)降低35%,200、400 μmol/L JA 處理后SOD活性分別降低70.7%(SOD 活性為48.67 U/g)和61.4%(SOD 活性為64.12 U/g);低溫脅迫處理4 h 后,與對照相比,50 μmol/L JA 處理的SOD 活性沒有發(fā)生顯著變化,但100 μmol/L JA 處理后SOD 酶活性增強32.8%,200、400 μmol/L JA 處理后SOD 活性分別增強64.4%和112.6%。表明在正常條件下JA 處理抑制了SOD 活性,且以200 μmol/L 效果最顯著,而在低溫脅迫處理后,SOD活性隨著JA 濃度的增加而增強。

    圖4 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下SOD 活性的影響Fig.4 Effects of different JA concentrations on SOD activity under cold stress

    2.3 JA 對馬鈴薯CBF 基因表達的影響

    如圖5 所示,馬鈴薯植株經(jīng)JA 和低溫脅迫處理后,檢測JA 響應Marker 基因MYC2的表達,結果發(fā)現(xiàn),在正常條件下JA 處理促進了MYC2 基因的表達,并且在100 μmol/L JA 處理后達到峰值,為對照的4.3 倍;進一步進行低溫脅迫處理4 h,MYC2 的表達與0 h 相比均有顯著地增強,其中100、200、400 μmol/L JA 處理分別比對照增強2.17、2.28、2.31 倍,表明JA 處理結果是可靠的。隨后分別對馬鈴薯CBF1、CBF2和CBF3的表達進行分析,結果(圖5)顯示,JA 處理24 h 后誘導3個CBF基因的表達,其中CBF1基因的表達在100 μmol/L JA 處理后達到最強,CBF2基因的表達在200 μmol/L JA 處理后最高,CBF3基因則在400 μmol/L JA 處理后效果最好;進一步的低溫脅迫處理4 h 后,發(fā)現(xiàn)3 個CBF基因的表達與0 h 對比均有顯著誘導,與對照相比,CBF1、CBF2、CBF3基因的表達在分別在50、100 μmol/L JA 處理后效果最好。表明JA 處理能夠增強抗寒關鍵基因CBF的表達,進一步提升馬鈴薯的抗寒性。

    圖5 不同JA 濃度處理及低溫脅迫對StCBFs 基因表達的影響Fig.5 Effects of different JA concentrations on the expression of StCBFs under cold stress

    3 討論

    低溫是限制植物生長、種群地理分布和農(nóng)藝性狀的重要環(huán)境因子[27]。許多植物已經(jīng)進化出適應低溫氣候的能力,并表現(xiàn)出局部的適應性狀[28]。低溫脅迫會誘導植物產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),進而造成植物膜脂過氧化,細胞膜系統(tǒng)損傷,甚至細胞死亡,最終會影響植物的正常生長[29]。在許多植物中已經(jīng)有研究表明,JA 參與調(diào)節(jié)ROS 的平衡機制,并且是通過影響ROS清除酶的活性實現(xiàn)的。本研究以馬鈴薯植株為研究對象,通過監(jiān)測不同濃度JA 對低溫脅迫條件下馬鈴薯植株ROS 清除酶活性的影響,篩選提升馬鈴薯植株抗寒性最適的JA 濃度,旨在為實踐生產(chǎn)中應用JA 提供一定參考。本研究發(fā)現(xiàn),隨著JA 處理濃度的提升,馬鈴薯葉片中過氧化氫的含量顯著降低,并且以200 μmol/L JA 處理效果最明顯,而低溫脅迫處理后各處理的過氧化氫含量均顯著增加,但100、200、400 μmol/L JA處理的過氧化氫含量顯著低于對照,表明JA 能夠顯著抑制過氧化氫的積累。同樣地,進一步分析ROS 清除機制中的3 種酶的活性,發(fā)現(xiàn)100、200 μmol/L JA 處理后CAT、POD 活性顯著升高,表明JA 通過調(diào)節(jié)CAT 和P OD 活性[30]來調(diào)節(jié)馬鈴薯葉片細胞內(nèi)ROS 的平衡,進而影響抗寒性;然而,SOD 活性在常溫和低溫脅迫條件下呈現(xiàn)出相反的趨勢,這可能是由于常溫條件下JA 促進CAT 和POD 活性降低了過氧化氫的含量,進而導致SOD 活性維持在較低水平,而在低溫脅迫下過氧化氫含量顯著升高,促進了SOD 活性提升,且此時JA 起著正調(diào)節(jié)的作用[30-31]。

    CBF家族基因是植物響應低溫脅迫的關鍵轉錄因子[23,32-33]。研究發(fā)現(xiàn),在許多植物中,低溫脅迫能夠激活CBF1-3的積累,并激活其下游COR(Cold-related)基因的表達,以提升植物的抗寒性[24,34]。JA 能夠正調(diào)節(jié)ICE-CBF 信號途徑,增強植物的抗寒性[35]。本研究發(fā)現(xiàn),在馬鈴薯中,JA 處理能夠誘導JA 信號Marker 基因MYC2的表達,表明JA 處理結果可靠;進一步對CBF1-3的表達進行分析表明,JA 處理能夠促進CBF1-3的表達,以100、200 μmol/L JA 處理效果最為顯著。經(jīng)低溫脅迫處理后,與正常條件相比,3 個CBF基因的表達均被誘導上調(diào),以50、100 μmol/L JA處理表達最高,且CBF2變化倍數(shù)最高達500多倍,可能作為主效基因,其次為CBF1和CBF3。其原因可能是低溫脅迫促進了內(nèi)源JA 的積累[29],從而促進了CBF1-3基因的表達。

    4 結論

    本研究結果表明,低溫脅迫條件下外源JA處理能夠提升馬鈴薯葉片活性氧清除酶CAT、SOD 和POD 活性,抑制活性氧的積累,提升馬鈴薯的低溫脅迫耐性,并且在一定范圍內(nèi)(0~400 μmol/L)隨著JA 濃度的增加ROS 清除酶的活性呈現(xiàn)出增強的趨勢;馬鈴薯適宜的茉莉酸處理濃度范圍為100~400 μmol/L,其中以200 μmol/L 效果最佳,此時能夠將活性氧清除酶CAT、POD 和SOD 活性分別提升30%、153%和64%,活性氧含量降低47.6%。此外,外源施加JA 能夠顯著促進抗寒關鍵基因StCBFs的表達,提升馬鈴薯的抗寒性,在實際生產(chǎn)中遭遇低溫寒潮時,可適當施用JA,減少損失。

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