基于廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)與近紅外技術(shù)的高低油酸花生鑒評(píng)

鄧權(quán)清，魯 清，劉 浩，洪彥彬，李海芬，梁炫強(qiáng)，王潤(rùn)風(fēng)，李少雄，陳小平

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】花生（Arachis hypogaeaL.）是一種世界性的油料和蛋白質(zhì)作物，也是我國(guó)四大油料作物之一，其單產(chǎn)和總產(chǎn)長(zhǎng)期居油料作物之首［1］。近年來(lái)，我國(guó)花生食品加工發(fā)展迅速，除了傳統(tǒng)食用植物油和副食品外，還開(kāi)發(fā)出極具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的花生營(yíng)養(yǎng)健康產(chǎn)品［2］。油酸是單不飽和脂肪酸，有較高的氧化穩(wěn)定性，能有效預(yù)防心血管疾?。?-3］。高油酸花生（油酸含量＞50%）突出的保健作用與經(jīng)濟(jì)效益，使得選育高油酸花生品種成為國(guó)內(nèi)花生品質(zhì)改良育種的目標(biāo)之一［3］。與其他植物油相比，高油酸花生油具有貨架期長(zhǎng)、不飽和脂肪酸含量高（如油酸與亞油酸含量占油脂80%）、無(wú)豆腥和不含植物芥酸等特點(diǎn)，越發(fā)受到花生榨油企業(yè)與消費(fèi)者青睞［4］。脂質(zhì)作為花生油脂的主要成分，其代謝物的轉(zhuǎn)化、合成與降解過(guò)程能夠動(dòng)態(tài)地影響著花生油脂的品質(zhì)［5］。然而，由于脂質(zhì)種類(lèi)多（其中主要成分為甘油三酯混合物），分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)階段鮮有對(duì)花生脂質(zhì)準(zhǔn)確定性定量的研究［6-7］。因此，探索一種能甄別品種與鑒評(píng)品質(zhì)的檢測(cè)方法，不僅能提高花生育種效率，還能為食品安全提供有效分析手段。

【前人研究進(jìn)展】花生栽培種屬于異源四倍體豆科作物，與其他模式作物相比，花生的基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱［8］?；ㄉ贩N鑒定主要通過(guò)形態(tài)特征和表型觀察，該法可靠性差、難以批量化操作［9］。隨著分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)在作物育種中普遍應(yīng)用，花生種質(zhì)也開(kāi)發(fā)出大量的分子標(biāo)記，如SSR、AFLP、RAPD 和RFLP 等［10-13］，但由于這些分子標(biāo)記特異性與重復(fù)性欠佳，導(dǎo)致分析結(jié)果可能有所差異。此外，植物油脂的質(zhì)量鑒定主要通過(guò)檢測(cè)脂肪酸的含量與成分，即脂肪酸分析水平［7］。近年來(lái)，油脂研究人員對(duì)脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與組成的研究愈發(fā)深入，直接推動(dòng)植物油脂檢測(cè)提升至脂質(zhì)分子層面［6-7］。

【本研究切入點(diǎn)】脂質(zhì)組學(xué)是通過(guò)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）技術(shù)對(duì)所有內(nèi)源性高豐度的脂質(zhì)分子進(jìn)行定性定量分析，從而更直觀地了解生物體內(nèi)各種脂質(zhì)代謝與合成的機(jī)理［6］。而應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)（Near infrared spectroscopy，NIRS）能夠準(zhǔn)確快速、批量化與標(biāo)準(zhǔn)化地測(cè)定這些花生品質(zhì)指標(biāo)［4］。本研究所利用得廣泛靶向脂質(zhì)代謝組技術(shù)綜合傳統(tǒng)靶向與非靶向代謝組檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)平臺(tái)的自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（Metware database）及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的手段研究樣品間的脂質(zhì)組差異［14-16］。同時(shí)，將脂質(zhì)與蛋白質(zhì)含量作為考察花生品質(zhì)的主要指標(biāo)［2］。

【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)利用廣泛靶向脂質(zhì)代謝組分析技術(shù)獲得高油酸花生與普通花生的核心差異脂質(zhì)代謝物，結(jié)合近紅外標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的品質(zhì)指標(biāo)，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)而聚類(lèi)生成可視化的特征圖譜，最終實(shí)現(xiàn)從表型與脂質(zhì)分子層面鑒評(píng)花生品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選取兩個(gè)高、低油酸花生品種，高油酸品種開(kāi)農(nóng)1715（KN1715）、低油酸品種冀花7 號(hào)JH7H。試驗(yàn)材料于2020 年秋季（7—11 月）種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地（113′ 44″E，23′ 39″N）。田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)種植36 株（6 行×6 列），行株間距20 cm，3 次重復(fù)。收獲時(shí)，每個(gè)花生品種隨機(jī)選取15 株進(jìn)行表型數(shù)據(jù)收集與廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 參照魯清等［17］的方法，農(nóng)藝性狀檢測(cè)指標(biāo)包括主莖長(zhǎng)、第一側(cè)枝長(zhǎng)、單株果數(shù)、單株飽果數(shù)、百果重、百仁重，并計(jì)算單株飽果率、單株秕果率與出仁率。

1.2.2 品質(zhì)性狀分析 花生收獲后，清洗成熟的花生莢果，去除表面泥土，40 ℃烘干脫水后，使用近紅外谷物分析儀DA7250（Perten，瑞典）對(duì)種子進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)，其中脂質(zhì)指標(biāo)包括脂肪（Fat）、油酸（Oleic acid，CHO）、亞油酸（Linoleic acid，CLA）、油酸/ 亞油酸含量比值（CHO/CLA）、棕櫚酸（Palmitic acid）、硬脂酸（Stearic acid）、花生酸（Arachidic acid）、山崳酸（Docosanoic acid）、二十四烷酸（Lignoceric acid），蛋白指標(biāo)包括蛋白質(zhì)（Protein，Pr）、氨基酸（Amino acid，AA）、蘇氨酸（Threonine，Thr）、纈氨酸（Valine，Val）、蛋氨酸（Methionine，Met）、異亮氨酸（Isoleucine，Ile）、亮氨酸（Leucine，Leu）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、賴(lài)氨酸（Lysine，Lys）、組氨酸（Histidine，His）、精氨酸（Arginine，Arg）、脯氨酸（Proline，Pro）［4］。

1.2.3 廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)分析 將烘干脫水后的花生種子（各品種3 個(gè)重復(fù)）用研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀；準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg 粉末，用1 mL 脂質(zhì)提取液提??；渦旋2 min，超聲5 min，加入500 μL 水；40 ℃，12 000 r/min 離心，吸取上清液500 μL 于1.5 mL 離心管中，真空冷凍干燥（VIRTIS，美國(guó)）濃縮，復(fù)溶后0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，保存于進(jìn)樣瓶中。后續(xù)的UPLCMS/MS 檢測(cè)與分析委托邁維（武漢）生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

花生農(nóng)藝與品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并利用GraphPad Prism 軟件繪圖。品種間采用成對(duì)T 檢驗(yàn)，使用SPSS 21 版軟件進(jìn)行。廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)的多元分析，如熱圖、火山圖、排序圖（Patterns hunter），主成分分析（Principal component analysis，PCA），偏最小二乘-判別分析PLS-DA（Partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）和得分圖通過(guò)MetaboAnalyst 軟件（http://www.metaboanalyst.ca）與圖圖云平臺(tái)（https://www.cloudtutu.com/）進(jìn)行［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 高、低油酸花生品種農(nóng)藝性狀比較

比較分析結(jié)果（圖1）表明，高、低油酸花生品種的農(nóng)藝性狀差異顯著，其中高油酸品種KN1715 的主莖、第一側(cè)枝長(zhǎng)度比低油酸品種JH7H 分別高11.72%和33.74%（圖1A、B），差異顯著；除單株秕果率外，KN1715 的單株果數(shù)、單株飽果率、百果重、百仁重與出仁率比JH7H 分別低46.23%、5.02%、5.35%、11.68% 和17.17%（圖1C～H），差異顯著。

圖1 高、低油酸花生的農(nóng)藝性狀Fig.1 Agronomic traits of high and low oleic acid peanuts

2.2 高、低油酸花生品質(zhì)性狀比較

由表1 可知，脂質(zhì)指標(biāo)中，KN1715 的油酸/亞油酸含量比值為JH7H 的8.79 倍，油酸、硬脂酸、花生酸含量比JH7H 分別高102.71%、25.00%、15.33%，但亞油酸、棕櫚酸、山崳酸、二十四烷酸含量分別低76.83%、18.83%、17.67%、23.64%，差異均達(dá)顯著水平；蛋白指標(biāo)中，與JH7H 相比，KN1715 的蛋白質(zhì)、氨基酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸與脯氨酸含量分別高16.35%、16.89%、16.47%、23.81%、17.54%、17.19%、18.63%、19.03%、19.81%、13.85%，差異顯著（表2）。

表1 高、低油酸花生種子脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量Table 1 Contents of lipid-related indexes of high and low oleic peanut seeds（%）

表2 高、低油酸花生種子蛋白相關(guān)指標(biāo)含量Table 2 Contents of protein-related indexes of high and low oleic peanut seeds（%）

2.3 高、低油酸花生脂質(zhì)組學(xué)特征

基于KN1715 與JH7H 的廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化數(shù)據(jù)分析，從而顯示出兩品種的總樣本特征（圖2）。熱圖結(jié)果表明，在兩個(gè)品種的種子中均鑒定出16 類(lèi)295 種脂質(zhì)代謝物，且兩品種間脂質(zhì)代謝物含量差異明顯（圖2A）。此外，各品種的3 個(gè)生物重復(fù)均能分別聚類(lèi)，說(shuō)明得到的數(shù)據(jù)重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)。火山圖根據(jù)差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C≥2，P≤0.05）進(jìn)一步篩選差異代謝物，結(jié)果表明，KN1715 中含量比JH7H 高的脂質(zhì)代謝物有90 種，比JH7H低的有114 種，無(wú)差異的有91 種（圖2 B）。

初步可視化結(jié)果（圖2）表明，高、低油酸花生品種中存在核心差異脂質(zhì)代謝物。為了進(jìn)一步分析KN1715 與JH7H 的脂質(zhì)代謝物變化規(guī)律，以顯著差異的測(cè)試數(shù)據(jù)為自變量進(jìn)行PCA 分析和偏最小PLS-DA 分析，以進(jìn)一步展現(xiàn)脂質(zhì)代謝測(cè)試數(shù)據(jù)的一致性，同時(shí)確定兩個(gè)品種分離的關(guān)鍵代謝物。同時(shí)，以PLS-DA 變量投影重要度（Variable importance in projection，VIP）衡量各測(cè)定指標(biāo)對(duì)各組樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助關(guān)鍵指標(biāo)的篩選（通常以VIP 值＞1.0 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)）。PCA 分析結(jié)果（圖3 A）表明，所有測(cè)定指標(biāo)降維為2 個(gè)主成分，分別為PC1 和PC2 方差百分比為99.4%和0.6%，其中PC1 可以很好地表征所有測(cè)定指標(biāo)99.4%的信息；PLS-DA 分析（圖3 B）則降維出2 個(gè)變量，即變量1（99.4%）和變量2（0.6%），其中變量1 也可以很好地表征所有測(cè)定指標(biāo)99.40%的信息。從圖3 C、D 可以看出，PCA 與PLS-DA分析結(jié)果均可以將KN1715、JH7H 的脂質(zhì)代謝物完全分離為兩組，根據(jù)PLS-DA 分析的變量1生成VIP 得分圖進(jìn)一步分析，以量化測(cè)定參數(shù)對(duì)兩個(gè)品種分離的貢獻(xiàn)。從圖3 E 可以看出，兩個(gè)品種中存在3 類(lèi)（即甘油二酯DG 3.10%、甘油三酯TG 93.80%、磷脂酰膽堿PC 3.10%）31 種脂質(zhì)代謝物的VIP 值＞1.0，說(shuō)明這31 種脂質(zhì)代謝物是形成兩品種分離的核心差異脂質(zhì)代謝物。

圖2 高、低油酸花生的脂質(zhì)組學(xué)總樣本特征Fig.2 Total sample characteristics of lipidomics of high and low oleic acid peanuts

圖3 脂質(zhì)代謝物的PCA 與PLS-DA 分析及PLS-DA 分析變量1 的VIP 得分Fig.3 PCA and PLS-DA analysis of lipid metabolites and variable importance in projection（VIP）to the component 1 of PLS-DA

2.4 脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的特征譜及其相關(guān)性

通過(guò)31 種脂質(zhì)組核心差異代謝物與標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析，可以得到鑒定花生品種的可視化脂質(zhì)組特征圖譜（圖4）。圖4結(jié)果顯示，脂質(zhì)代謝物與品質(zhì)指標(biāo)在KN1715 與JH7H 兩個(gè)高、低油酸品種間具有明顯的差異，在KN1715 中，有19 種脂質(zhì)分子含量顯著上調(diào)，其余12 種則相反，這也可作為區(qū)分高油酸花生與普通花生的特異性脂質(zhì)生物標(biāo)志物。

圖4 脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的特征譜Fig.4 Characteristics mapping for core differential lipidomics metabolites and the quality indexes

對(duì)脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，既可進(jìn)一步探索代謝物與表型的關(guān)系，也佐證脂質(zhì)組核心差異代謝物。圖5A 結(jié)果表明，高油酸花生品種代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性熱圖，紅、藍(lán)與白分別表示正、負(fù)、無(wú)相關(guān)性，其顏色越深相關(guān)性越強(qiáng)。由于KN1715 與JH7H 分別為高、低油酸品種，故重點(diǎn)關(guān)注與油酸相關(guān)的指標(biāo)。由圖5 可知，油酸與部分指標(biāo)（LIPID-P-0860、LIPID-P-0861、LIPID-P-0795、LIPID-P-0796、LIPID-P-0157、LIPID-P-0797、LIPID-P-0881、LIPID-P-0879、LIPID-P-0869、LIPID-P-0804、LIPID-P-0822、CHO/CLA、LIPID-P-0817、LIPID-P-0931、LIPID-P-0814、LIPID-P-0812、LIPID-P-0329、LIPID-P-0807、LIPID-P-0932、LIPID-P-0803、硬脂酸C18:0、花生酸、Met、Phe、Arg、Pro、Ile、AA、Leu、His、Pr、Val）之間存在顯著正相關(guān)，與Fat、Thr、Lys 及兩各品種均無(wú)顯著相關(guān)性外，與其他指標(biāo)之間則存在顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)而對(duì)所有與油酸密切相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行分類(lèi)排序，根據(jù)相關(guān)系數(shù)＞0.5 進(jìn)行選擇，與油酸相關(guān)性由強(qiáng)到弱排序的結(jié)果見(jiàn)圖5 B。

圖5 脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性熱圖（A）及與油酸相關(guān)的指標(biāo)排序圖（B）Fig.5 Heat map（A）for core differential lipidomics metabolites and the quality indicators,and the top indexes correlated with oleic acid（B）

3 討論

本研究首次利用近紅外光譜技術(shù)與廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)，基于高、低油酸花生的品質(zhì)指標(biāo)與種類(lèi)繁多的脂質(zhì)分子的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析，最終獲得品種鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)兼?zhèn)涞谋硇团c脂質(zhì)分子特征圖譜，以及篩選高油酸花生特異性脂質(zhì)生物標(biāo)志物。目前，近紅外光譜技術(shù)作為一種無(wú)損、快速、低成本的檢測(cè)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定與選育［19］、作物品質(zhì)評(píng)價(jià)［20］和食用植物油脂與油料品質(zhì)檢測(cè)［21］。本研究結(jié)果顯示，油酸與亞油酸含量成反比，這與禹山林等［22］最先利用近紅外技術(shù)測(cè)定花生的油脂與蛋白質(zhì)含量的結(jié)果類(lèi)似。本研究中，基于近紅外光譜檢測(cè)到的物質(zhì)均是脂肪酸水平的脂質(zhì)代謝物。而花生油作為廣東省主要的食用油之一，其不斷增加的市場(chǎng)需求，導(dǎo)致不良商家使用不健康或較便宜的油進(jìn)行摻假，而摻假物與純花生油脂的光譜非常相似，因此，研制能識(shí)別和量化相應(yīng)摻假物的通用、可靠的分析方法是今后研究的重要方向［23］。

脂質(zhì)組學(xué)主要的研究對(duì)象是較高豐度的內(nèi)源性脂質(zhì)代謝物，而且其普遍采用的研究手段是UPLC-MS/MS 技術(shù)，使得該技術(shù)天然具備高穩(wěn)定與高精度屬性。因此，廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)成功應(yīng)用于不同領(lǐng)域，如長(zhǎng)鏈脂肪酸的生物合成與棉纖維發(fā)育［24］、植物細(xì)胞表面脂質(zhì)鹽受體［25］。本研究使用UPLC-MS/MS 廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)對(duì)2 個(gè)油酸差異顯著的花生品種進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析最終得到3 類(lèi)31 種核心差異脂質(zhì)分子，即甘油三酯（93.80%）、甘油二酯（3.10%）和磷脂酰膽堿（3.10%）。甘油三酯作為植物油脂的主要成分，在植物脂質(zhì)代謝途徑中起到關(guān)鍵作用［26］，而甘油三酯的功能決定于其骨架結(jié)構(gòu)上的脂肪酸種類(lèi)［7］，這也是本研究中31 種核心差異脂質(zhì)代謝物的來(lái)源。此外，近年來(lái)多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析已被廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種與生理生化等機(jī)理研究［27-28］，本研究利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)花生表型組與脂質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行集成分析，并初步獲得與油酸含量相關(guān)的表型與脂質(zhì)組指標(biāo)，這些結(jié)果將為揭示花生脂質(zhì)合成與代謝機(jī)制提供研究思路與理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究分析了成熟期高、低油酸花生KN1715 與JH7H 的表型性狀（農(nóng)藝與品質(zhì)性狀）與脂質(zhì)組的差異。就表型性狀而言，KN1715 的主莖、第一側(cè)枝長(zhǎng)度、油酸、硬脂酸、花生酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸與脯氨酸含量顯著高于JH7H；就脂質(zhì)組而言，兩品種間存在較大的差異，共篩選到16 類(lèi)295 種脂質(zhì)分子，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)差異代謝物多元統(tǒng)計(jì)分析，最終篩選到3 類(lèi)31 種核心差異脂質(zhì)分子，其在花生品種鑒定起到關(guān)鍵作用。另外，本研究集成近紅外與廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，獲得KN1715 與JH7H的可視化脂質(zhì)組特征圖譜，建立從品質(zhì)表型與脂質(zhì)分子層面進(jìn)行花生品種鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)的新型分析方法。