沉默BECN1對人三陰性乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響*

鐘 俊，樊海波，張浩然，黃鳳婷，黃錦明，云雪燕，劉志明

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧 530007）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)報道，2020年女性乳腺癌成為全球惡性腫瘤發(fā)病的首位，已經(jīng)超越肺癌成為最常見的惡性腫瘤[1]，其中三陰性乳腺癌（triple-negtive breast cancer，TNBC）具有較高的侵襲性，是乳腺癌中預(yù)后最差的亞型[2]。目前，針對雌激素受體（estrogen receptor，ER）或人類表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor 2，HER2）陽性的乳腺癌應(yīng)用內(nèi)分泌治療和分子靶向治療均可取得良好的效果。但是，對于TNBC 的臨床治療效果不佳。因此，為TNBC尋找更有效的、新的治療方法成為研究的熱點。

自噬是一個細胞通過吞噬自身細胞成分并與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，降解所囊括內(nèi)容物的過程，借此循環(huán)細胞成分來完成細胞的代謝需求和維持能量穩(wěn)態(tài)[3]。發(fā)生在正常組織和細胞中的自噬，是細胞對代謝和缺氧應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，對正常細胞的存活具有保護性作用[4]，自噬也參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腫瘤的耐藥過程，但其作用機制仍未明了。自噬是多分子參與的復(fù)雜過程，研究表明，beclin 1（BECN1）作為特異性的自噬基因，屬于自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATGs），是調(diào)控自噬的重要分子[5]。BECN1通過作用于吞噬泡的形成與成熟，影響自噬體的表達，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的自噬水平[6]。有研究報道，通過沉默結(jié)腸癌細胞中BECN1 基因發(fā)現(xiàn)抑制自噬后能明顯抑制細胞增殖并且促進凋亡[7]，而抑制自噬活性與TNBC 細胞增殖與凋亡的相關(guān)研究鮮有報道。本研究探討通過在TNBC MDA-MB-231細胞中沉默BECN1基因的表達觀察其對細胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 人TNBC MDA-MB-231細胞購自上海中喬新舟公司；

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國GIBCO公司）；胰酶、RIPA 裂解液（美國Sigma 公司）；沉默BECN1慢病毒的組1、組2、組3 及陰性對照慢病毒均由上海吉凱生物公司合成；總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒、PCR引物、實時熒光定量PCR試劑盒（日本Takara 公司）；兔抗人BECN-1 單克隆抗體、兔抗人LC3B單克隆抗體、兔抗人Gapdh單克隆抗體、兔二抗（美國Proteintech公司）；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（美國MCE公司）；Transwell小室、基質(zhì)膠（美國corning 公司）；AnnexinV-APC/7-AAD 染色試劑盒、細胞周期試劑盒（杭州聯(lián)科公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細胞使用含10%胎牛血清、100 U/mL青—鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基），培養(yǎng)于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.3 細胞分組與慢病毒感染 將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種到6孔板，當融合度達到60%時，以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為10，將含有陰性對照（negative control，NC）慢病毒感染組、3種沉默BECN1慢病毒分別感染干擾組1、干擾組2以及干擾組3，空白組不做處理。在72 h后于熒光顯微鏡下檢測細胞熒光情況，然后給予含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基持續(xù)篩選兩周。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）實驗檢測各組信使核糖核酸的表達 收集生長狀態(tài)良好的各組細胞，提取各組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），在RT-qPCR 儀StepOnePlus 上進行PCR 擴增，反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃，30 s（1 個循環(huán)）；變性，95 ℃，5 s；60 ℃退火，延伸30 s，共40 個循環(huán)。BECN1 引物序列，上游：5’-CCAGATGCGTTATGC-CCAGAC-3’，下游：5’-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3’。應(yīng)用2-ΔΔCT法計算BECN1 mRNA的相對表達量。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blotting，WB)實驗檢測蛋白的表達 收集各組細胞的總蛋白，BCA法檢測總蛋白的濃度。加入適量上樣緩沖液，于金屬浴機中煮沸10 min 使蛋白變性，SDS-PAGE 凝膠電泳（60 V/150 min），濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜（110 mA，120 min），封閉液室溫封閉15 min，一抗4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜3 次，5 min/次；二抗室溫搖床孵育2 h，使用ECL 液孵育30 s，掃膜及分析條帶灰度值，使用Image J 分別計算BECN1 與自噬特異性蛋白LC3B的相對表達量。

1.6 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的各組細胞制備成單細胞懸液，使用完全培養(yǎng)基將細胞數(shù)量調(diào)整至5×104個/mL，取每孔100 μL 接種于96 孔板進行培養(yǎng)，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃反應(yīng)1 h，使用酶標儀在450 nm 波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。

1.7 細胞侵襲與遷移實驗 在細胞侵襲實驗中，將被稀釋后的基質(zhì)膠（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：基質(zhì)膠=9∶1）加入Transwell 小室的上室并放入培養(yǎng)箱孵育2 h，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將生長狀態(tài)良好的各組細胞制備成5×105個/mL 的細胞懸液，取100 μL 將細胞接種于Transwell小室的上室，將600 μL完全培養(yǎng)基加入小室的下室，放入培養(yǎng)箱孵育24 h 后，加入細胞固定液，0.1%結(jié)晶紫染色液后隨機選取5 個視野于顯微鏡下拍照并計數(shù)；在細胞遷移實驗中，除了不需要在Transwell小室的上室加入基質(zhì)膠，其余步驟等同于侵襲實驗。

1.8 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 將細胞培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗兩次，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞后離心5 min，棄上清，用1 mL 1×的Binding Buffer 重懸細胞后將細胞加入1.5 mL的EP 管，接著分別加入10 μL 的APC 和5 μL 的7-AAD 進行染色，室溫避光孵育10 min 后上機檢測，計算細胞凋亡率。

1.9 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期 將細胞培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞后離心5 min，棄上清，用1 mL的DNA Staining solution 重懸細胞后加入1.5 mL 的EP 管，接著加入10 μL 的Permeabilization solution，室溫避光孵育30 min后上機檢測，計算各期細胞的比例。1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準（）差表示，多組間的比較使用單因素方差分析，組間兩兩的比較使用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞BECN1 mRNA的表達情況 RT-qPCR結(jié)果顯示：與空白組、NC組相比，干擾組BECN1 mRNA的相對表達量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），空白組與NC 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。其中干擾組2的相對表達量最低，用于后續(xù)的實驗，見圖1。

圖1 各組細胞BECN1 mRNA相對表達量比較

2.2 各組細胞BECN1 蛋白與LC3B 蛋白的相對表達量比較 WB檢測結(jié)果顯示：干擾組BECN1蛋白的相對表達量以及LC3B蛋白中LC3-Ⅱ/LC31-Ⅰ的比值低于空白組和NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中干擾組2 兩種蛋白的相對表達量均最低，干擾組2用于后續(xù)的實驗，見圖2。

圖2 各組細胞BECN1與LC3B蛋白相對表達量比較

2.3 3組細胞形態(tài)比較 通過顯微鏡觀察細胞的生長，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間后，相較于空白組與NC 組，干擾組2 的細胞生長緩慢，細胞間隙增大，且細胞形態(tài)呈細長狀，見圖3。

圖3 3組細胞形態(tài)的比較（×200）

2.4 3組細胞增殖實驗比較 CCK-8法檢測細胞增殖能力的實驗結(jié)果顯示：干擾組2 的細胞活力相較于空白組與NC 組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表示干擾組2的增殖能力下降，見圖4。2.5 3組細胞遷移實驗比較 Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：干擾組2（204±18.38）穿過基底膜細胞數(shù)比空白組（377.5±31.81）和NC組（331.5±13.43）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖4 3組細胞增殖能力比較

圖5 3組細胞遷移能力比較（×200）

2.6 3 組細胞侵襲實驗比較 侵襲實驗結(jié)果顯示：與空白組（111±7.07）和NC 組（112.5±2.12）比較，干擾組2（54.5±6.36）穿過基底膜的細胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 3組細胞侵襲能力比較（×200）

2.7 3組細胞凋亡與細胞周期分布檢測 流式細胞術(shù)凋亡實驗結(jié)果顯示：干擾組2 的細胞凋亡率（0.85±0.03）%與空白組（0.87±0.13）%、NC組（1.21±0.08）%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。細胞周期實驗結(jié)果顯示，與空白組（55.3±4.84）%、NC 組（54.32±1.69）%比較，干擾組2（62.6±1.79）%的細胞處于G0/G1期的比例更高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖8。

圖7 3組細胞的凋亡率比較

圖8 3組細胞的細胞周期分布比較

3 討論

自噬是細胞中普遍存在的生理機制，也在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腫瘤的耐藥過程中起著重要的作用。LC3B 是判斷自噬活性的特異性自噬標志蛋白。LC3B 蛋白有兩種形式，在自噬形成時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ緊密連接在自噬囊泡膜表面[8]。因此，通過WB 檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可反映細胞自噬水平的高低。當兩者的比值減少時，表示自噬水平降低。

BECN1 是調(diào)控細胞自噬水平的關(guān)鍵基因[9]，與自噬囊泡的形成相關(guān)。有研究報道BECN1 在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤中表達缺失，甚至在多種TNBC細胞株中同樣存在BECN1基因的缺失，但不包括MDA-MB-231 細胞[10]。BECN1 是一種抑癌基因[11]，在胃癌細胞中過表達BECN1促進自噬能明顯抑制增殖、遷移與侵襲能力[12]；本課題組前期研究也表明：隱丹參酮通過過表達MDA-MB-231 細胞BECN1，促進自噬從而抑制增殖、侵襲與遷移能力[13]。然而，BECN1 在食管癌、結(jié)腸癌等腫瘤中呈現(xiàn)相反作用。劉飛等[14]研究表明：沉默食管癌細胞BECN1 基因，可抑制自噬，進而減弱癌細胞侵襲與遷移能力；湯俊照[15]則發(fā)現(xiàn)，過表達喉癌細胞BECN1 可促進細胞的增殖。由此可知，BECN1 在不同腫瘤細胞具有截然不同的作用。目前，通過沉默BECN1 抑制自噬與TNBC 細胞增殖及凋亡關(guān)系的研究鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)沉默MDA-MB-231細胞BECN1 表達，細胞的增殖、遷移與侵襲能力均被明顯抑制。此外，流式細胞實驗發(fā)現(xiàn)各組細胞凋亡率沒有明顯差異，干擾組細胞增殖速度較對照組慢。我們推斷沉默BECN1 表達可降低細胞的自噬水平，繼而阻止MDA-MB-231細胞從G0/G1期進入S期，導(dǎo)致細胞周期停滯，從而抑制細胞增殖，其具體分子機制與調(diào)控通路有待進一步研究。本課題組前期研究還表明：沉默MDA-MB-231 細胞BECN1表達可提高多西他賽對細胞的敏感性，降低其增殖能力[16]，但能否同時提高其他化療藥物對MDAMB-231細胞的敏感性仍需后續(xù)深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)沉默BECN1表達可明顯降低MDA-MB-231 細胞自噬水平，抑制細胞增殖，使細胞周期停滯于G0/G1期，同時減弱細胞遷移及侵襲能力。這一成果為靶向TNBC BECN1 基因治療提供了初步的實驗依據(jù)，也為治療TNBC 提供了新的治療思路。