Let-7b-5p靶向ETFA減輕高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究*

陳傳珍，盧海林，覃 曉

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科，南寧 530021）

血管鈣化是指鈣鹽沉積在動(dòng)脈壁組織的一種病理改變，可導(dǎo)致血管彈性的喪失和血管僵硬，是心血管疾病發(fā)展的病理基礎(chǔ)[1-3]。據(jù)報(bào)道，在65歲以上的人群中，約40%的死亡是由心血管疾病引起的[4]。血管鈣化既往被認(rèn)為是一個(gè)被動(dòng)的、不可避免的病理過程。然而，最近的研究結(jié)果表明，從血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）表型到成骨細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變是血管鈣化發(fā)生的主要原因[5]，血管鈣化是一個(gè)主動(dòng)的、受調(diào)控的過程，與骨和軟骨形成類似[6-7]。盡管血管鈣化的分子機(jī)制已經(jīng)有很多研究，但仍缺乏有效的預(yù)防和治療方法。因此，迫切需要進(jìn)一步探尋血管鈣化的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)。

MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA 主要通過與靶基因的3’UTR 結(jié)合后抑制其表達(dá)[8]，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種重要的調(diào)節(jié)作用，可以作為潛在的治療目標(biāo)和診斷生物標(biāo)志物[9-10]。大量miRNAs 在血管疾病中發(fā)揮著重要作用。miR-204/miR-211 通過調(diào)節(jié)BMP2 減輕血管鈣化[11]。miR-34a 通過調(diào)節(jié)SIRT1促進(jìn)血管鈣化[12]。同時(shí)，在動(dòng)脈粥樣硬化的血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了低表達(dá)的Let-7b-5p[13]。有研究表明，在平滑肌細(xì)胞中通過抑制Let-7b-5p通過上調(diào)電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A（ETFA）表達(dá)促進(jìn)維生素D 受體的積累，從而阻止多裂肌功能障礙的發(fā)展[14]，維生素D介導(dǎo)的成骨細(xì)胞因子Runx2表達(dá)調(diào)控是血管鈣化的必需條件[15-16]。但Let-7b-5p是否能夠逆轉(zhuǎn)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，減少鈣磷沉淀而抑制血管鈣化進(jìn)展目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過高磷誘導(dǎo)VSMCs 鈣化，觀察Let-7b-5p 對VSMCs 鈣化程度和表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響，并探討Let-7b-5p 對ETFA的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) VSMCs購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。VSMCs 用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基。

1.2 分組、鈣化模型的建立及轉(zhuǎn)染 將VSMCs 分為8 組：正常對照組、鈣化組、Let-7b-5p mimic 組、mimic control 組、Let-7b-5p inhibitor 組、inhibitor control 組、ETFA-siRNA 組和siRNA-Control 組。正常對照組用普通DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，不予任何干預(yù)，其他各組用含有10 mmol/L β-甘油磷酸鈉（β-GP）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs 14 d誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化。造模14 d 后，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipo 8000（上海碧云天公司）說明書的步驟，分別轉(zhuǎn)染Let-7b-5p mimic、let-7b-5p inhibitor、ETFA siRNA 及相應(yīng)的陰性對照（廣州瑞博公司）。

1.3 茜素紅染色檢測VSMCs鈣化情況 取對數(shù)生長期的VSMCs 按1×105個(gè)/mL 密度接種于6 孔板中，PBS 洗滌后，加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min；棄去多聚甲醛溶液，用PBS 洗滌細(xì)胞，加入1%茜素紅溶液（pH=4.2）對細(xì)胞進(jìn)行染色10 min，倒置顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況（鈣沉積陽性細(xì)胞呈紫紅色），拍照，用Image J軟件分析陽性染色面積所占百分比。

1.4 堿性磷酸酶（ALP）染色觀察VSMCs成骨分化取對數(shù)生長期的VSMCs按1×105個(gè)/mL密度接種于6 孔板中，PBS 洗滌后，加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min；棄去多聚甲醛溶液，PBS 洗滌3 次，加入適量ALP 染色液（碧云天），染色30 min 后，在光學(xué)顯微鏡下觀察VSMCs 成骨分化情況（陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)灰褐色至深黑色顆粒狀或片狀沉淀）、拍照，Image J軟件分析陽性染色面積所占百分比。

1.5 細(xì)胞ALP活性檢測 取對數(shù)生長期的VSMCs按1×105個(gè)/mL密度接種于6孔板中，PBS清洗3次，加入100 μL 細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，離心，取上清；加入ALP 檢測試劑盒工作液，用槍頭輕輕吹打混勻，37 ℃孵育10 min，用酶標(biāo)儀檢測405 nm 波長處的吸光度值。

1.6 RT-qPCR法檢測Let-7b-5p、Runx2、ETFAmRNA相對表達(dá)量 轉(zhuǎn)染48 h后，用NucleoZOL RNA提取試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI 7500型PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物由廣州復(fù)能基因公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列如下：Runx2 上游：5’-CATGGCCGGGAATGATGAG-3’，下游：5’-TGTGAAGACCGTTA-TGGTCAAAGTG-3’；ETFA 上游：5’-CAGCAGCAAGTGGAGGTAGT-3’，下游：5’-CCAGTTAGCTCTGGTCGGTC-3’；β-actin 上游：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’；Let-7b-5p 上游：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游：5’-TGCTTGAGGTAGTAGGTTG-3’。ETFA 和Runx2 的表達(dá)以β-actin 為內(nèi)參，Let-7b-5p 的表達(dá)以U6 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.7 Western blotting 法檢測Runx2 和ETFA 蛋白表達(dá)量 使用RIPA 裂解液裂解VSMCs，提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度；每組取20 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；室溫封閉1 h，加入一抗Runx2（Abcom-236639，1∶5 000）、ETFA（Proteintech-12262-1-AP，1∶1 000）、GAPDH（Proteintech-13937-1-AP，1∶1 000）4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜；加入相應(yīng)的二抗（Proteintech-SA00001-2，1∶5 000）室溫孵育1 h，PBST洗膜；ECL發(fā)光液顯色、曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)量。

1.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 利用在線公共數(shù)據(jù)庫RNA22（https://cm.jefferson.edu/rna22/）檢索Let-7b-5p與ETFA結(jié)合位點(diǎn)。為了確定Let-7b-5p與ETFA之間的靶向關(guān)系，在HEK293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型（WT）ETFA 3’-UTR或突變型（MUT）ETFA 3’-UTR和Let-7b-5p mimic 或相應(yīng)陰性對照（NC）。使用熒光素酶活性檢測試劑盒測定細(xì)胞螢火蟲熒光素酶的活性，以海腎熒光素酶的熒光值為標(biāo)準(zhǔn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)分析法分析ETFA 與Let-7b-5p、Runx2 表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs 鈣化情況 與正常對照組比較，鈣化組VSMCs 出現(xiàn)大量的紫紅色鈣結(jié)節(jié)及大量的藍(lán)黑色硫化鈷沉淀（P＜0.001），即鈣化程度和成骨分化程度增加，見圖1。

圖1 VSMCs茜素紅染色（A）和ALP染色（B）結(jié)果

2.2 Let-7b-5p 和ETFA 參與VSMCs 的鈣化 與正常對照組比較，鈣化組Runx2 和ETFA mRNA 相對表達(dá)量顯著升高，Let-7b-5p 表達(dá)顯著降低（均P＜0.01），見圖2A、2B、2C。Pearson相關(guān)分析顯示：ETFA 與Let-7b-5p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.785，P＜0.001），ETFA與Runx2表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.962，P＜0.001），見圖2D、2E。

圖2 正常對照組與鈣化組Runx2、ETFA和Let-7b-5p的表達(dá)比較

2.3 Let-7b-5p 可調(diào)節(jié)ETFA 和Runx2 的表達(dá) 與mimic control 組比較，Let-7b-5p mimic 組Runx2 和ETFA mRNA 及蛋白相對表達(dá)量顯著降低，ALP 活性降低（均P＜0.05）；與inhibitor control組比較，Let-7b-5p inhibitor組Runx2和ETFA mRNA及蛋白相對表達(dá)量顯著升高，ALP活性升高（均P＜0.05），見圖3。

圖3 Let-7b-5p對VSMCs中ETFA和Runx2的調(diào)節(jié)作用

2.4 Let-7b-5p靶向調(diào)控ETFA的表達(dá) 通過RNA22在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，Let-7b-5p與ETFA 3’-UTR第80～104 位的堿基存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Let-7b-5P 是否能夠調(diào)節(jié)ETFA的表達(dá)。Let-7b-5p mimic組與NC mimic組熒光素酶活性比較無明顯差異（P＞0.05）；與ETFAWT+NC mimic 組比較，與ETFA-WT+Let-7b-5p mimic 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與ETFA-WT+Let-7b-5p mimic 組比較，ETFA-MUT+Let-7b-5p mimic 組熒光素酶活性顯著升高（P＜0.05），見圖4B。

圖4 Let-7b-5p對ETFA的靶向調(diào)控作用

2.5 沉默ETFA 可減輕VSMCs 的鈣化與siRNAControl 組比較，ETFA-siRNA 組VSMCs 中ETFA 和Runx2 mRNA相對表達(dá)量顯著下降（均P＜0.01），紫紅色鈣結(jié)節(jié)明顯減少，見圖5。

圖5 沉默ETFA后ETFA、Runx2的表達(dá)及茜素紅染色

3 討論

血管鈣化是心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子和常見病理變化，與高血壓、糖尿病、慢性腎病和衰老等密切相關(guān)。血管鈣化包括血管內(nèi)膜鈣化和中層鈣化。內(nèi)膜鈣化主要是由血管的慢性炎癥引起的，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。中層鈣化主要指VSMCs 向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過程，這是一個(gè)主動(dòng)的、受到調(diào)控的過程。目前認(rèn)為，血管中層的VSMCs 向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變是導(dǎo)致血管鈣化的重要因素[2]。這種細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變使血管平滑肌標(biāo)志物（SM22α和SMα-肌動(dòng)蛋白）減少，骨形成標(biāo)志物（Runx2 和ALP）增加[7,17]。

最新的證據(jù)表明，miRNAs參與靶基因的表達(dá)，在血管鈣化過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，Let-7b-5p可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[13]。電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白（ETF）是一種酶，參與氧化呼吸鏈過程，與脂肪酸代謝等有關(guān)[18]，影響線粒體脂酰輔酶A的積累，在脂類疾病中發(fā)揮重要作用。人類ETF由兩個(gè)獨(dú)立的基因ETFA和ETFB分別編碼。ETFA與細(xì)胞凋亡有關(guān)。在發(fā)生凋亡的肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的ETFA蛋白[19]。本研究用10 mmol/L β-GP 誘導(dǎo)VSMCs 鈣化，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)干預(yù)后的VSMCs 出現(xiàn)大量的紫紅色鈣結(jié)節(jié)，表明高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化程度增加。

ALP是成骨細(xì)胞的表型標(biāo)志物之一，可反映成骨細(xì)胞的增殖活性。ALP 不僅能促進(jìn)VSMCs 表型分化，而且可通過水解磷酸酯提高磷酸鹽濃度，水解焦磷酸鹽増加磷酸鈣的生成，最終加速血管鈣化發(fā)展。本研究中，鈣化組VSMCs 成骨分化程度（ALP 陽性染色面積）明顯增加，成骨細(xì)胞因子Runx2表達(dá)上調(diào)，ETFA表達(dá)上調(diào)，而Let-7b-5p表達(dá)下調(diào)；相關(guān)性分析顯示，Let-7b-5p表達(dá)與ETFA呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，Runx2 表達(dá)與ETFA 呈正相關(guān)關(guān)系；轉(zhuǎn)染Let-7b-5p mimic 后，Runx2 和ETFA mRNA 和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，ALP活性降低，而Let-7b-5p inhibitor的作用相反；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明了Let-7b-5p可靶向抑制ETFA 的表達(dá)。以上結(jié)果說明，Let-7b-5p 可通過抑制ETFA 表達(dá)減輕VSMCs 的成骨分化。此外，沉默ETFA 后，Runx2 和ETFA mRNA 和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，茜素紅染色顯示細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)明顯減少，與Let-7b-5p mimic 的作用相一致。表明沉默ETFA表達(dá)能抑制血管鈣化。

綜上所述，Let-7b-5p 和ETFA 參與血管鈣化過程，Let-7b-5p 可通過下調(diào)ETFA 的表達(dá)抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化。本課題組下一步將研究ETFA是否通過VDR 通路或者其他途徑來發(fā)揮抗血管鈣化的作用，以期完善血管鈣化的分子調(diào)控機(jī)制和提供血管鈣化的靶向基因治療選擇。