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    酶解骨粉對低鈣大鼠的補(bǔ)鈣功效研究

    2022-01-23 08:35:28李玉娟肖楠劉珊劉菲菲隋巖
    關(guān)鍵詞:骨鈣骨粉吸收率

    李玉娟, 肖楠, 劉珊, 劉菲菲, 隋巖

    (1. 北京理工大學(xué) 生命學(xué)院,北京 100081;2.內(nèi)蒙古天奇生物科技有限公司,內(nèi)蒙古,赤峰市 024000)

    鈣是人體所需的常量元素之一,能維持機(jī)體細(xì)胞正常功能. 人體99%的鈣元素以羥基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齒中,其余游離鈣存在于血液、軟組織和細(xì)胞外液,形成混溶鈣池,骨骼中的鈣和混溶鈣池保持動態(tài)平衡[1]. 人體長期鈣含量攝入不足則會打破這個(gè)動態(tài)平衡,導(dǎo)致骨鈣儲留不足,引起骨質(zhì)疏松、佝僂癥等代謝性骨病的發(fā)生[2-3]. 根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的WS/T578.2—2018《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》,青少年每日鈣推薦攝入量為1 000~1 200 mg,成年人為800~1 000 mg. 但2019年中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報(bào)告顯示,我國居民的膳食營養(yǎng)素中平均鈣攝入量不足營養(yǎng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的50%,缺鈣現(xiàn)象在兒童、孕婦及老人等人群中則更為明顯[4]. 合理選擇補(bǔ)鈣制劑對改善我國居民鈣攝入量不足有重大意義.

    目前,上市的補(bǔ)鈣制劑種類較多,主要包括無機(jī)酸鈣(如碳酸鈣、磷酸氫鈣等)、有機(jī)酸鈣(葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣、氨基酸螯合鈣、L-蘇糖酸鈣)等. 雖然碳酸鈣片劑目前市場占有率比較高,但其小腸吸收率僅有30%;葡萄糖酸鈣和乳酸鈣比碳酸鈣溶解性更好,但其含鈣量相對較低;L-蘇糖酸鈣的吸收率很高但價(jià)格昂貴[5]. 針對目前補(bǔ)鈣產(chǎn)品的現(xiàn)狀,亟待研發(fā)新型的補(bǔ)鈣制劑. 酶解骨粉(enzymatic hydrolyzed bone powder, EBP)是對牛骨物理處理后,采用酶水解法得到的產(chǎn)品,其具有鈣含量高、鈣易吸收的優(yōu)勢[6-7],但目前全面評價(jià)酶解骨粉的相關(guān)研究較為少見. 本研究采用低鈣飼料喂養(yǎng)構(gòu)建低鈣大鼠模型,灌胃給予大鼠酶解骨粉,通過檢測股骨組織病理學(xué)、骨密度、股骨干重與灰重、骨鈣與骨磷含量、生物力學(xué)指標(biāo)、鈣表觀吸收率等,以期全面評價(jià)酶解骨粉的補(bǔ)鈣功效,為其臨床應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ).

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 儀器和試劑

    RM2235石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);DPX骨密度儀(美國LUNAR公司);1195電子拉伸機(jī)(英國Instron公司);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);Centrifuge 5424高速臺式離心機(jī)(美國Eppendorf公司);BP61電子分析天平(德國Sartorius公司);DHP-9052A電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京陸??萍加邢薰?;902型-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo公司);7500ce電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Bedford公司).

    酶解骨粉(含鈣量為25%,內(nèi)蒙古天奇生物科技有限公司,批號20191212,保質(zhì)期三年);碳酸鈣(優(yōu)級純,含鈣量為40%,石家莊西默科技有限公司,批號20191017,保質(zhì)期兩年);水合氯醛(分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號J22J10H90920,保質(zhì)期兩年).

    低鈣飼料配制(含鈣量10~20 mg/kg,北京互持生物科技有限公司,批號20191209,保質(zhì)期三個(gè)月)[8]:酪蛋白10.0%,黃豆粉15.0%,小麥面粉54.0%,玉米油4.0%,纖維素2.0%,混合鹽2.6%,混合維生素 1.0%,氯化膽堿0.2%,dl-蛋氨酸0.2%, 淀粉11.0%.

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物

    4周齡雄性SD大鼠60只,SPF級,體重(80±10)g,由中國食品藥品檢定研究院提供,經(jīng)動物倫理委員會同意,許可證號:SCXK(京)2017-0005. 屏障環(huán)境飼養(yǎng),環(huán)境溫度(24 ± 2)℃,相對濕度40%~60%,12 h光/12 h暗交替. 自由采食和飲水. 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,期間自由攝食飲水.

    1.3 構(gòu)建低鈣模型與給藥

    4周齡健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對照組(CON)、低鈣模型組(MOD)、酶解骨粉低、中、高劑量組(分別記做LEBP、MEBP、HEBP)和陽性藥碳酸鈣(POS)組,每組10只. 對照組飼以正常飼料,自由飲水,其余各組大鼠給予低鈣飼料6周,自由飲用去離子水. 第7周開始,連續(xù)4周給與各組大鼠200、400、800 mg/kg的酶解骨粉混懸液、500 mg/kg的碳酸鈣混懸液,低鈣模型組和對照組大鼠灌胃給與等量去離子水.

    1.4 鈣代謝實(shí)驗(yàn)

    灌胃給藥最后3天進(jìn)行鈣代謝實(shí)驗(yàn). 將大鼠移入代謝籠,分籠喂養(yǎng). 記錄3天進(jìn)食量,連續(xù)收集72 h糞便,80 ℃烘干,稱重,記錄糞便量. 將鼠糞研細(xì)、過篩、混勻、消化,采用火焰原子吸收法測定糞鈣含量,計(jì)算鈣的表觀吸收率,計(jì)算公式如下:

    攝入鈣=飼料中鈣含量×飼料消耗量

    糞鈣=鼠糞中鈣含量×糞便量

    鈣的表觀吸收率=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100%

    1.5 樣本收集

    末次給受試物后禁食24 h,大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3 g/kg),待其麻醉后,剪開大鼠腿部皮膚,將大鼠左右兩側(cè)股骨剝離干凈,剔除脛骨上附著的肌肉組織和韌帶. 左側(cè)股骨用生理鹽水浸濕的紗布包裹,-80 ℃凍存;右側(cè)股骨固定于4%多聚甲醛中,4 ℃保存.

    1.6 病理學(xué)檢查

    將固定于組織固定液中的大鼠右側(cè)股骨用磷酸鹽緩沖液漂洗,置于4.13%的EDTA-2Na溶液(pH 7.4)中4 ℃脫鈣30天. 脫鈣完全后,以流水沖洗30 min,然后將右側(cè)后肢股骨上1/3端沿正中矢狀面剖開,石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察.

    1.7 骨密度、生物力學(xué)指標(biāo)檢測

    取大鼠左側(cè)股骨置于DPX骨密度儀測試臺上,掃描并測定股骨中點(diǎn)密度. 在1195電子拉伸機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn). 將左側(cè)股骨放置于支座上,使其橫截面短軸方向與載荷方向保持一致,跨距為17 mm,加載速度為3 mm/min. 通過所得載荷-撓度曲線得到位移、斜率、強(qiáng)度力學(xué)指標(biāo).

    1.8 股骨干重、灰重、骨鈣、骨磷含量測定

    去除左側(cè)股骨軟組織,用生理鹽水沖去骨髓,在環(huán)流熱空氣高熱箱中120 ℃烘干1 h,用三氯甲烷和甲醇(2∶1)混合液浸泡72 h脫脂,烤箱120 ℃烘干6 h,稱量其干重. 然后置于馬福爐中600 ℃灰化6 h,測量其灰重. 采用火焰原子吸收法測定骨鈣、骨磷含量.

    2 數(shù)據(jù)處理

    運(yùn)用Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析. 數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,組間差異比較采用單因素方差分析,p< 0.05表示有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

    3 結(jié)果與討論

    3.1 酶解骨粉有效改善股骨組織病理學(xué)

    采用HE染色對各組大鼠右側(cè)股骨進(jìn)行組織病理學(xué)觀察和病理評分,結(jié)果如圖1所示. 與對照組相比,模型組骨皮質(zhì)厚度降低,骨基質(zhì)黏液變性加重,骨小梁數(shù)量顯著減少且局部結(jié)構(gòu)紊亂,骨髓腔明顯擴(kuò)大,骨膜增生嚴(yán)重,表明長期低鈣飼養(yǎng)使模型組大鼠骨密度降低,骨脆性增加. 給與酶解骨粉后大鼠股骨中骨皮質(zhì)厚度提高,骨小梁數(shù)量顯著增加,骨髓腔面積減小,其中高劑量酶解骨粉和陽性藥組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)最為清晰(圖1(e),1(f)),表明酶解骨粉對低鈣導(dǎo)致的骨小梁減少和結(jié)構(gòu)紊亂有很好的保護(hù)作用.

    3.2 酶解骨粉提高低鈣大鼠的鈣表觀吸收率

    通過鈣代謝實(shí)驗(yàn)計(jì)算各組大鼠的鈣表觀吸收率,結(jié)果見表1. 模型組大鼠鈣表觀吸收率為-96.5%,與對照組相比顯著降低(p< 0.01),說明鈣流失嚴(yán)重. 給予低鈣大鼠酶解骨粉后,低、中、高劑量組的鈣表觀吸收率依次為-2.55%、-1.57%和-0.283%,顯示大鼠體內(nèi)鈣表觀吸收率均顯著增加(與模型組相比,p< 0.01),且隨著劑量的增加而提高. 以上結(jié)果說明酶解骨粉能有效緩解低鈣大鼠的骨鈣流失,有助于低鈣大鼠的鈣表觀吸收率恢復(fù)到正常水平.

    表1 大鼠鈣表觀吸收率

    3.3 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨密度、生物力學(xué)指標(biāo)的影響

    通過骨密度儀和三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)檢測大鼠股骨密度及生物力學(xué)指標(biāo)(位移、斜率、強(qiáng)度),測定結(jié)果如表2所示. 相較于對照組,模型組大鼠股骨密度降低了17.8%. 與模型組相比,低、中、高劑量酶解骨粉組大鼠的股骨密度逐漸升高,高劑量組和陽性藥組大鼠股骨密度分別提高了14.1%和15.1%. 位移、斜率和強(qiáng)度都是衡量骨骼強(qiáng)度的重要力學(xué)指標(biāo),可以反映骨生長代謝狀況. 模型組大鼠股骨位移和斜率均低于對照組大鼠,但未見顯著差異. 給予低鈣大鼠各劑量酶解骨粉后,大鼠股骨位移和斜率都表現(xiàn)出升高趨勢,而股骨強(qiáng)度表現(xiàn)無顯著規(guī)律. 以上結(jié)果表明,高劑量酶解骨粉能有效提升低鈣大鼠的股骨密度,并且對股骨力學(xué)性能的提高或有積極作用.

    表2 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨骨密度和生物力學(xué)指標(biāo)的影響

    3.4 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨干重、灰重、骨鈣和骨磷含量的影響

    大鼠股骨干重(dry weight of femur)、灰重(ash weight of femur)、骨鈣(Ca-bone)和骨磷(P-bone)的測定結(jié)果如圖2所示. 與對照組相比,模型組大鼠股骨干重、灰重均顯著降低(p< 0.01),分別減少了13.7%、15.1%. 酶解骨粉給藥大鼠的股骨干重、灰重隨著給藥劑量的增加而上升,干灰重比也略有提高,但與模型組相比未見顯著性差異. 與對照組相比,模型組大鼠股骨的骨鈣、骨磷分別降低了16.4%、16.9%. 三個(gè)劑量組的酶解骨粉均能顯著提高低鈣大鼠的骨鈣和骨磷含量(與模型組相比,p< 0.01). 低劑量酶解骨粉組升高大鼠股的骨鈣和骨磷含量效果最為顯著(與模型組相比,p<0.01),分別提高了13.0%和15.0%,且效果顯著優(yōu)于陽性藥碳酸鈣. 以上結(jié)果說明酶解骨粉能有效提高低鈣大鼠骨骼中鈣磷酸鹽等礦物質(zhì)含量,促進(jìn)骨基質(zhì)中的鈣沉積,加快骨形成,從而發(fā)揮補(bǔ)鈣作用. 酶解骨粉對低鈣大鼠股骨鈣與磷含量的提升作用并未表現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系,低劑量酶解骨粉的作用最為顯著,或更能有效提高股骨中鈣磷酸鹽的含量.

    圖2 各組大鼠股骨干重、灰重、骨鈣和骨磷含量

    4 結(jié)束語

    鈣主要經(jīng)小腸吸收,通過糞便和尿液排出,極少量通過皮膚經(jīng)汗液排出[9]. 人體的鈣吸收率一般為30%~80%[10]. 鈣代謝平衡實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的營養(yǎng)學(xué)研究方法[11],鈣表觀吸收率表示了鈣元素在體內(nèi)吸收利用情況,鈣表觀吸收率高表示攝入的鈣在體內(nèi)的吸收效果好,其易受性別、鼠齡、環(huán)境、飼料成分等影響. 本研究除對照組大鼠之外,其余組均給予相同的低鈣飼料,含鈣量為10~20 mg/kg(維持飼料含鈣量為10~18 g/kg). 有研究表明鈣的攝入量會影響鈣表觀吸收率[12],鈣攝入過少會導(dǎo)致“鈣饑餓”,導(dǎo)致機(jī)體最大化吸收利用鈣,使鈣表觀吸收率顯著增加,鈣攝入過多則會降低鈣吸收. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,低鈣飼養(yǎng)導(dǎo)致大鼠鈣流失嚴(yán)重,酶解骨粉能顯著提高低鈣大鼠的鈣表觀吸收率. 相對于模型組,低劑量酶解骨粉組大鼠的鈣表觀吸收率有顯著的提高,鈣流失大大減少,隨著酶解骨粉給藥劑量的提高,大鼠的鈣表觀吸收率上升幅度則明顯減緩.

    缺鈣會導(dǎo)致骨密度和骨強(qiáng)度下降,嚴(yán)重會引起骨質(zhì)疏松和佝僂癥. 骨密度是骨骼強(qiáng)度的一個(gè)重要指標(biāo),是衡量骨質(zhì)疏松程度的標(biāo)準(zhǔn)之一[13]. 良好的補(bǔ)鈣劑能有效提高骨密度. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,酶解骨粉能有效提高低鈣大鼠的骨密度,降低骨髓腔部分面積,恢復(fù)骨小梁致密結(jié)構(gòu). 高劑量酶解骨粉組大鼠股骨密度顯著增加,與碳酸鈣給藥大鼠股骨密度水平相當(dāng). 骨骼中礦物質(zhì)的含量是決定骨密度的因素之一,鈣磷以羥磷灰鈣的形式構(gòu)成骨鹽,其比值大約為2∶1,并處于穩(wěn)定狀態(tài)[14]. 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,隨著酶解骨粉劑量的增加,大鼠的股骨干重和灰重有增加趨勢,中劑量酶解骨粉組大鼠股骨的干灰重比的提高最為顯著. 各酶解骨粉組大鼠股骨中鈣、磷含量均顯著升高. 骨干灰重比、骨鈣和骨磷含量越高,均說明了酶解骨粉有良好的補(bǔ)鈣效果.

    酶解骨粉以新鮮牛骨為原料,利用酶水解法促進(jìn)骨骼中鈣的轉(zhuǎn)化,使骨鈣充分分離出來,含有天然生物鈣、骨膠原蛋白,骨粉中鈣磷比適宜(約為2∶1). 酶解骨粉中的骨鈣與人體內(nèi)游離氨基酸作用生成可溶性氨基酸鈣,有助于鈣的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收. 骨膠原蛋白和鈣離子形成螯合物,能進(jìn)一步促進(jìn)鈣的利用. 此外,牛骨組成與人體骨組織相似,和人體骨細(xì)胞有較強(qiáng)的親和力,或許也是酶解骨粉生物利用率較高的原因之一,但其補(bǔ)鈣機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.

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