沉默YAP1可能通過調控mTOR/p70s6k信號通路對卵巢癌細胞生長和轉移的影響

高 翔,鄭 磊,肖獻花,李貴梅,劉永軍,于 華,魏 聘

(1.邯鄲市第一醫(yī)院 婦科,河北 邯鄲 056000；2.邯鄲市婦幼保健院，河北 邯鄲 056000)

卵巢癌是常見的女性癌癥，其死亡率是女性癌癥之首，發(fā)病率在女性癌癥中位居第三[1]。因為早期卵巢癌臨床癥狀不明顯，缺乏可靠的診斷技術，導致早期卵巢癌患者常常被忽視，多數卵巢癌患者確診時已經處于中晚期，早已錯過最佳治療時期[2-3]。隨著醫(yī)學領域不斷發(fā)展，分子生物靶向治療已成為當前卵巢癌研究的熱點和重點。Yes相關蛋白(YAP1)在多種癌癥內高表達，可以調控癌細胞內基因或信號途徑進而參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展，與腫瘤分期、淋巴結轉移、總生存率和不良預后有關[4-5]。毛靜月等[6]研究結果顯示，沉默YAP1能夠抑制卵巢癌細胞的增殖和阻滯細胞周期，并誘導細胞的凋亡。mTOR/p70S6K信號通路在癌癥的發(fā)展中具有重要的意義，能夠參與多種癌癥的生長、轉移等[7-8]，有研究發(fā)現，EPR29可能抑制mTOR通路相關蛋白抑制卵巢癌細胞的增殖和轉移[9]。關于YAP1和mTOR/p70S6K信號通路兩者之間在卵巢癌的研究中尚不清楚，因此，本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌細胞SKOV3，探討沉默YAP1是否能夠通過調控mTOR/p70s6k信號通路影響卵巢癌細胞生長和轉移，旨在為卵巢癌的診斷和治療提供合理的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 卵巢癌細胞SKOV3購自美國ATCC保藏中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自上海百研生物；青霉素、鏈霉素購自Gibco公司；Lipofectamine 3000試劑盒購自Invitrogen公司；si-NC、si-YAP1、引物購自賽默飛世爾；mTOR通路激活劑3-BDO購自Sigma公司；TRIizol試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；CCK8試劑盒購自美國Millipore公司；YAP1抗體、Ki67抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、p-mTOR抗體、p-p70s6k抗體、mTOR抗體、p70s6k抗體、GAPDH抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢博士德生物；Transwell和基質膠購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組 將卵巢癌細胞SKOV3常規(guī)復蘇在含有10%胎牛血清、雙抗(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基內，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育培養(yǎng)，細胞密度融合生長至80%～85%時，加入胰蛋白酶進行消化傳代。取對數生長期的卵巢癌細胞SKOV3，接種在6孔板內(密度為1×105個/mL)，然后按照Lipofectamine 3000試劑盒將si-NC、si-YAP1轉染至細胞內，記為si-NC組、si-YAP1組；轉染si-YAP1至細胞后，加入100 μmol/L的mTOR通路激活劑3-BDO，記為si-YAP1+3-BDO組。細胞培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測YAP1 mRNA的表達量 按照TRIizol法提取1.2各組卵巢癌細胞SKOV3內總RNA，檢測RNA濃度和純度后，根據逆轉錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉錄為cDNA，將cDNA加入SYBR Green進行PCR擴增。根據2-ΔΔCt計算公式檢測YAP1 mRNA的表達量。YAP1上游引物為：5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′，下游引物為：5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′；β-actin上游引物為：5′-TCACCAACTGGGACGACATG-3′，下游引物為：5′-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3′。

1.4 CCK8檢測細胞活力 取1.2各組卵巢癌細胞SKOV3，PBS清洗細胞，然后重懸細胞接種96孔板內(密度為2×103個/孔)，經過培養(yǎng)48 h，在每孔內10 μL的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標儀在450 nm處檢測細胞的吸光度值，計算細胞活力。

1.5 Western blot檢測YAP1、Ki67、E-cadherin、N-cadherin和mTOR/p70s6k通路相關蛋白的表達 在1.2各組卵巢癌細胞SKOV3內添加蛋白裂解液，冰上裂解30 min，BCA法檢測蛋白濃度，取35 μg蛋白采用SDS-PAGE電泳分離處理，并轉移在PVDF膜上，脫脂奶粉封閉培養(yǎng)1 h，加入YAP1、Ki67、E-cadherin、N-cadherin、p-mTOR、p-p70s6k、mTOR、p70s6k和GAPDH抗體，4℃過夜孵育，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1 h，滴加化學發(fā)光液顯影、曝光。以GAPDH作為內參，分析目的蛋白的表達。

1.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：取1.2各組卵巢癌細胞SKOV3加入胰蛋白酶消化后，采用不含血清DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，并調整細胞密度至5×104個/mL，取200 μL接種在Transwell上室內，在下室內加入500 μL含有血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)箱內取出小室，采用多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色10 min，選取明亮的視野在顯微鏡下觀察細胞遷移數目。

侵襲實驗：將不含血清DMEM培養(yǎng)基與基質膠按照8∶1比例稀釋基質膠，在Transwell上室鋪稀釋的基質膠，放置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5 h，后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

2 結果

2.1 沉默YAP1在卵巢癌細胞SKOV3中的表達 與si-NC組相比，si-YAP1組內YAP1 mRNA(0.94±0.08比0.39±0.04，t=18.848,P<0.05)和蛋白表達(0.88±0.07比0.32±0.03，t=22.059,P<0.05)顯著降低，見圖1。

圖1 沉默YAP1在卵巢癌細胞SKOV3中的蛋白表達

2.2 沉默YAP1對卵巢癌細胞SKOV3增殖的影響 與si-NC組相比，si-YAP1組內細胞活力顯著降低(P<0.05)，Ki67蛋白表達顯著降低(P<0.05，見圖2)。

*：與si-NC組比較，P<0.05。

2.3 沉默YAP1對卵巢癌細胞SKOV3遷移和侵襲的影響 與si-NC組相比，si-YAP1組內遷移細胞數目和侵襲細胞數目顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達顯著增加(P<0.05)，N-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖3。

*：與si-NC組比較，P<0.05。

2.4 沉默YAP1對mTOR/p70s6k信號通路相關蛋白表達的影響 與si-NC組相比，si-YAP1組內p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達顯著降低(P<0.05)，mTOR、p70s6k蛋白表達沒有顯著變化；與si-YAP1組相比，si-YAP1+3-BDO組內p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達顯著增加(P<0.05)，mTOR、p70s6k蛋白表達沒有顯著變化(見圖4)。

圖4 沉默YAP1對mTOR/p70s6k信號通路相關蛋白表達的影響

2.5 沉默YAP1可能通過調控mTOR/p70s6k信號通路對卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移和侵襲的影響 與si-YAP1組相比，si-YAP1+3-BDO組內細胞活力、遷移細胞數目和侵襲細胞數目顯著增加(P<0.001)，Ki67、N-cadherin蛋白表達顯著增加(P<0.001)，E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.001)，見圖5和表1。

圖5 沉默YAP1可能通過調控mTOR/p70s6k信號通路對卵巢癌細胞SKOV3增殖和轉移相關蛋白的影響

表1 沉默YAP1可能通過調控mTOR/p70s6k信號通路對卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

卵巢癌是一種具有高度轉移、侵襲的惡性腫瘤，其惡性程度較高，目前其治療方法以手術治療為主，化療為輔，但是還會出現85%的復發(fā)情況[10]，因此，尋找卵巢癌安全有效的治療方法迫在眉睫。YAP基因位于染色體11q13區(qū)域，最早Sudol等于1994年發(fā)現，是一種多種功能的細胞連接蛋白和轉錄因子，通過參與細胞細胞增殖、遷移、侵襲等影響腫瘤的發(fā)展[11-12]。近年的研究結果顯示，YAP1在癌癥內起到促癌的作用，如YAP1在宮頸癌細胞內高表達，沉默YAP1能夠抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲[13]。周雅青等[14]在研究鼻咽癌中發(fā)現，沉默YAP1能夠抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在胰腺癌研究中發(fā)現，敲除YAP1能抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移[15]。YAP1在卵巢癌組織內表達上調，與患者的臨床分期及不良預后密切相關[16]，抑制YAP1能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲[17]。本研究將si-YAP1轉染卵巢癌細胞SKOV3后，通過qRT-PCR和Western blot實驗檢測YAP1 mRNA表達量和蛋白表達水平，結果顯示，沉默YAP1組內YAP1 mRNA表達量和蛋白表達下調，說明沉默YAP1在卵巢癌起著抑癌的作用。通過功能實驗觀察沉默YAP1對卵巢癌細胞生長和轉移的作用，結果發(fā)現，沉默YAP1能夠抑制細胞活力、遷移細胞數目和侵襲細胞數目，下調Ki67、N-cadherin蛋白表達，上調E-cadherin蛋白表達，說明沉默YAP1能抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這與上述研究結果一致。

mTOR是一種高度保守、進化完整的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠介導多個信號通路參與腫瘤細胞的生長和轉移等，mTOR信號通路通過下游P70S6K發(fā)揮作用，可直接被mTOR磷酸化[18-19]。唐男等[20]研究結果顯示，mTOR、p70S6K在上皮性卵巢癌組織內高表達，與手術病理分期、病理分級顯著相關，說明mTOR、p70S6K與卵巢癌發(fā)展有關。有研究發(fā)現，腎上腺髓質素能介導mTOR信號通路參與卵巢癌細胞增殖，具有一定促癌作用[21]。以上均說明mTOR信號通路與卵巢癌的發(fā)展密切相關。本研究結果顯示，將si-YAP1轉染卵巢癌細胞SKOV3后，p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達下調，而mTOR、p70s6k蛋白表達不受影響，說明沉默YAP1能夠調控mTOR/p70s6k信號通路的表達。采用mTOR通路激活劑3-BDO處理卵巢癌細胞后，發(fā)現p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達上調，能促進細胞活力、遷移細胞數目和侵襲細胞數目，上調Ki67、N-cadherin蛋白表達，下調E-cadherin蛋白表達，說明沉默YAP1可能通過激活mTOR/p70s6k信號通路的表達發(fā)揮在卵巢癌中的作用。

綜上所述，沉默YAP1在卵巢癌細胞內表達下調，沉默YAP1能夠抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與mTOR/p70s6k信號通路有關。