發(fā)酵飼料對育肥期文昌雞消化酶活性及抗氧化功能的影響①

溫瓊 李笑春

（海南大學(xué) 海南 ?？?570000）

文昌雞是海南省唯一的國家級禽類優(yōu)良地方保護(hù)品種，深受海南當(dāng)?shù)厝说南矏?。文昌雞對自然條件、飼養(yǎng)管理和飼喂方式要求不高，適應(yīng)性強(qiáng)。傳統(tǒng)文昌雞養(yǎng)殖方式分為籠養(yǎng)和放養(yǎng)，主要飼喂油脂、大米、番薯等加水煮熟之后的混合物，這種傳統(tǒng)育肥方式費(fèi)時費(fèi)力耗能。養(yǎng)殖過程中，海南文昌雞的腸道消化吸收和抗氧化功能是重要保障，發(fā)酵飼料能夠降低飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子、增加飼料有效能值、改善腸道菌群平衡、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、提高飼料消化利用率等多種優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)［1］。通過分析發(fā)酵飼料的飼喂對育肥期文昌雞消化吸收和抗氧化的影響，可為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)［2‐3］。本試驗(yàn)使用育肥期文昌雞混合飼料，以酵母菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌作為發(fā)酵菌種，利用最優(yōu)發(fā)酵工藝制作發(fā)酵飼料。通過對文昌雞飼喂不同比例的發(fā)酵飼料，揭示發(fā)酵飼料對育肥期文昌雞抗氧化功能和腸道消化吸收功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對象

試驗(yàn)選用105日齡體重相近、狀態(tài)良好的文昌母雞160只。隨機(jī)將試驗(yàn)雞分為對照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組4個處理，每處理8個重復(fù)，每重復(fù)5只雞。

采購飼料原料，經(jīng)加工配制成文昌雞育肥期混合飼料（表1），對照組采用全價日糧飼喂，其它三組分別飼喂10%、20%、30%的發(fā)酵飼料替代全價料。

表1 發(fā)酵原料配方及營養(yǎng)水平

1.2 發(fā)酵飼料

分別使用釀酒酵母菌、植物源性乳酸菌、蠟樣芽孢桿菌3種菌株制備種子液，按釀酒酵母菌0.6×108cfu＋蠟樣芽孢桿菌4×1011cfu＋植物源性乳酸桿菌1.35×108cfu配比制備活化液，將0.34 kg活化菌液加入8～9 kg水中攪勻，然后加入20 kg混合飼料中攪拌均勻，發(fā)酵5 d。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵飼料對育肥期文昌雞消化酶的影響

取樣：從每個重復(fù)組中隨機(jī)抽取2只文昌雞屠宰、解剖、剪取腸段（十二指腸、空腸、回腸）、收集新鮮食糜約5 g，放入到離心管里，做好標(biāo)記，液氮速凍，‐80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

測定指標(biāo)：按照α‐淀粉酶測試盒、脂肪酶測定試劑盒、胰蛋白酶測定試劑盒、糜蛋白酶測定試劑盒要求，測定育肥期文昌雞母雞十二指腸、空腸和回腸消化酶活力。為了減小誤差，進(jìn)行2次平行試驗(yàn)。

樣品預(yù)處理：取出冷凍的三段腸食糜，放入4℃冰箱解凍。準(zhǔn)確稱取5 g腸道內(nèi)容物，按質(zhì)量體積1∶9加入冰冷生理鹽水（或pH＝7.4的PBS勻漿緩沖液），保溫盒裝入冰塊，低溫將食糜研磨成勻漿，放入離心管中。以2 500 r/min離心10 min，用移液器取上清液，做好標(biāo)記分裝。為了減小誤差，進(jìn)行兩次平行試驗(yàn)。

測定原理：α‐淀粉酶能水解淀粉生成的葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物濃度已知情況下，加入碘液與未水解的淀粉結(jié)合生成藍(lán)色復(fù)合物，根據(jù)藍(lán)色的深淺可推算出水解的淀粉量，計算AMS的活性。

脂肪酶：甘油三酯和水制成的乳膠，因其膠束對射入光的吸收及散射而具有乳濁性狀。膠束中的甘油三酯在脂肪酶的作用下發(fā)生水解，使膠束分裂，散裂光或濁度因而減低，減低的速率與脂肪酶活力有關(guān)。

1.3.2 發(fā)酵飼料對育肥期文昌雞抗氧化機(jī)能的影響

取樣：每個重復(fù)中隨機(jī)取2只文昌雞，翅靜脈采血。血液靜置，以3 000 r/min離心10 min，用移液槍將血清分別裝入EP管中，放入‐20℃保存。

測定指標(biāo)：4℃解凍預(yù)處理樣品。然后依次測定十二指腸、空腸和回腸的谷胱甘肽過氧化物歧化酶活性、超氧化物歧化酶活性、總抗氧化能力、丙二醛含量、過氧化氫酶的活性。

測定原理：過氧化氫酶分解H2O2可通過加入鉬酸銨迅速中止，H2O2與鉬酸銨作用生成一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定，可計算出CAT的活力。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH‐PX）可以促進(jìn)過氧化氫與還原性谷胱甘肽反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽過氧化物酶的活力，可用酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)還原型谷胱甘肽的消耗，可求出酶的活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)OD值和濃度測定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品OD值代入方程計算，得到數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)，記錄最終結(jié)果即為樣品的實(shí)際濃度。利用Micro‐soft Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，行單因素方差分析結(jié)合LSD比較分析，數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，p＜0.01表示差異極顯著，p＞0.05為差異不顯著，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵飼料對十二指腸消化酶的影響

由表2可以看出，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組的文昌雞十二指腸淀粉酶含量、糜蛋白酶活性均顯著高于對照組；脂肪酶含量差異不顯著（p＞0.05），試驗(yàn)Ⅰ組最高；胰蛋白酶含量異不顯著（p＞0.05），試驗(yàn)Ⅰ組活性高于對照組。

表2 文昌雞十二指腸消化酶測定結(jié)果

2.2 發(fā)酵飼料對空腸消化酶的影響

由表3可以看出，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組文昌雞空腸淀粉酶極顯著高于對照組（p＜0.01），糜蛋白酶含量極顯著低于對照組（p＜0.01）；各試驗(yàn)組脂肪酶活性、胰蛋白酶活性沒有顯著差異（p＞0.05）。

表3 文昌雞空腸消化酶測定結(jié)果

2.3 發(fā)酵飼料對回腸消化酶的影響

由表4可以看出，試驗(yàn)Ⅰ組文昌雞回腸淀粉酶、胰蛋白酶均極顯著高于對照組（p＜0.01），糜蛋白酶活性極顯著低于對照組（p＜0.01）各處理胰蛋白酶的活性差異不顯著（p＞0.05），試驗(yàn)Ⅰ組胰蛋白酶含量最高。

表4 文昌雞回腸消化酶測定結(jié)果

2.4 發(fā)酵飼料對回腸抗氧化性的影響

由表5可以看出，各處理總抗氧化能力（T‐AOC）差異不顯著，試驗(yàn)組超氧化物歧化酶（SOD）含量顯著高與對照組，試驗(yàn)Ⅰ組過氧化酶（CAT）顯著高于對照組（p＜0.05），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH‐PX）活性差異不顯著，試驗(yàn)Ⅰ組的丙二醛（MDA）含量顯著低于對照組（p＜0.05）。

表5 文昌雞的抗氧化指標(biāo)

3 討論

腸道消化酶主要來源于三種途徑，通過環(huán)境或者食物從外界獲取，自身機(jī)體代謝分泌獲取以及機(jī)體的腸道微生物［4］。脂肪酶是特殊的酯鍵水解酶，控制消化吸收；淀粉酶主要水解淀粉和糖原；胰蛋白酶和糜蛋白酶屬于蛋白分解酶，在水解過程中，能夠分解消化飼料中的氨基酸。混合飼料在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生小分子肽等物質(zhì)，文昌雞通過飼喂從外界獲取，再經(jīng)過自身的消化轉(zhuǎn)化被吸收和利用。腸道消化酶中，淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶和糜蛋白酶有著重要作用，影響飼料的消化利用。消化酶活性升高，可推論動物機(jī)體對日糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力高，這有利于動物的生長發(fā)育。因此，添加發(fā)酵飼料能不同程度提高雞十二指腸消化酶、淀粉酶和總蛋白水解酶的活性，這點(diǎn)與本研究結(jié)果一致。本研究使用的是酵母菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌為菌種的發(fā)酵飼料。試驗(yàn)組糜蛋白酶活性均低于對照組，可能是由于本試驗(yàn)所用的發(fā)酵飼料營養(yǎng)物質(zhì)中粗蛋白含量偏低所致。試驗(yàn)組中脂肪酶與胰蛋白酶活性出現(xiàn)先上升后下降趨勢。隨著發(fā)酵飼料添加量的增加，食糜酸性增加，為消化酶發(fā)揮作用提供了良好環(huán)境，增加了小腸消化酶活力。因此，發(fā)酵飼料可以一定程度上改善雞小腸消化機(jī)能，但當(dāng)發(fā)酵飼料添加量過多，微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生酸類物造成動物腸道pH值下降，影響脂肪酶和胰蛋白酶的分泌和活性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加10%發(fā)酵飼料，腸道對發(fā)酵飼糧的養(yǎng)分利用率更高，有助于育肥期文昌雞母雞對飼料的消化吸收及利用。說明發(fā)酵飼料的添加能提高酶活性，這可能是由于飼料中的菌群能能更好被吸收溶解，進(jìn)一步提高了酶的活性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

雞血液指標(biāo)改變能夠綜合反映機(jī)體的健康程度，機(jī)體自身也能通過免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)維持穩(wěn)定。GSH‐Px、SOD、CAT和AOC都是動物機(jī)體重要的抗氧化酶。大量資料證實(shí)，丙二醛（MDA）會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的生物膜因過氧化而損傷，引發(fā)機(jī)體細(xì)胞和組織的變異，從而引起一系列健康問題。因此，機(jī)體內(nèi)丙二醛（MDA）的含量可以間接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度以及細(xì)胞的受損情況。血清中超氧化物歧化酶（SOD）常與丙二醛（MDA）結(jié)合輔助探究機(jī)體抗氧化性能，其活性可以側(cè)面體現(xiàn)機(jī)體清除自由基的能力［5］。超氧化物歧化酶（SOD）對動物機(jī)體的氧化與抗氧化平衡更具有不可替代作用［6］，可以及時清除機(jī)體內(nèi)需氧生物代謝遺留的氧自由基，還能保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受損傷［7］。動物機(jī)體在代謝過程中會產(chǎn)生大量過氧化氫，然而，過氧化氫卻是加速身體衰老的元兇，會對健康造成威脅。過氧化氫酶（CAT）的主要可以將過氧化氫分解成水和氧氣，從而減少由于過氧化氫對動物機(jī)體氧化而造成的傷害［8］。動物機(jī)體中也存在其他與過氧化氫分解有關(guān)的酶，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH‐PX）是存在最廣泛的一種酶，其特有的催化還原型谷胱甘肽可以還原過氧化氫，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用［9］。這一氧化還原反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗量［10］即可反應(yīng)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH‐PX）的活力。

本研究試驗(yàn)Ⅰ組AOC活性比對照組高，這意味著發(fā)酵飼料可以增強(qiáng)機(jī)體的總抗氧化能力，對文昌雞機(jī)體的抗氧化能力有積極作用，發(fā)酵飼料可以顯著提高育肥期文昌雞血清中的超氧化物歧化酶、過氧化酶、谷胱甘肽過氧化物歧化酶活性。

綜合考慮，認(rèn)為10%發(fā)酵飼料的添加組能夠提升機(jī)體的抗氧化功能。