荔枝草有效成分的提取及其抑菌功效研究

◎ 杜曉映

（濰坊理工學(xué)院，山東 青州 262500）

荔枝草（Salvia plebeiaR.Br.）為唇形科鼠尾草屬植物，別稱雪見草、癩蛤蟆草、過冬草等，具有清熱涼血，利尿解毒，消腫止痛的功效[1]，煎服治扁桃體炎、肺結(jié)核咳血、血小板減少性紫癜，外用治跌打青腫、瘡毒、痔瘡腫痛、乳腺炎等。除西藏、青海、甘肅、新疆以外全國(guó)都有分布，廣泛分布于亞洲及大洋洲[2]。

荔枝草抗氧化活性強(qiáng)，其提取物作為抗氧化劑可用于藥品、保健品、食品、化妝品中[3-4]。郭仁永等[5]對(duì)荔枝草的研究表明，荔枝草水煎液具有減少咳嗽、祛痰平喘的作用。近年來有學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分、應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行研究表明，荔枝草中主要含有二萜類、三萜類、黃酮類、木質(zhì)素、苯丙素以及甾醇和揮發(fā)油類等多類化學(xué)成分，具有抑菌、止咳平喘、祛痰及抗組胺硒、抗癌、抗肝損等生物活性[6-7]。劉慧清等[8]從荔枝草乙醇提取物中得到13個(gè)化合物，其中粗毛豚草素、澤蘭黃酮、高車前苷和假荊芥屬含量較高。

我國(guó)荔枝草資源豐富，有很高的開發(fā)價(jià)值，本試驗(yàn)從荔枝草中提取有效成分，并對(duì)其成分進(jìn)行抑菌功效研究，為進(jìn)一步利用荔枝草開發(fā)功能性產(chǎn)品提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

荔枝草干草從河南省泌陽縣購(gòu)買。大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、青霉（Penicillium）由濰坊理工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。普通變形菌（Proteus vulgars）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）購(gòu)于上海魯微科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

主要設(shè)備如表1所示。

表1 設(shè)備匯總表

1.3 荔枝草浸膏提取

荔枝草的干燥全草，除去黃葉、雜質(zhì)，研碎成粗粉（或過40目篩），分別稱取荔枝草粗粉10 g共9份。以乙醇濃度（A）、乙醇添加量（B）、回流時(shí)間（C）3個(gè)因素做正交試驗(yàn)（表2）。浸泡12 h后，回流、抽濾、50 ℃減壓蒸餾得到浸膏。以出膏率為測(cè)定指標(biāo)，分析各因素影響的程度，選取較佳提取方案。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 抑菌試驗(yàn)

以牛津杯周圍抑菌圈的大小代表待測(cè)試劑的抗菌能力。按照無菌操作技術(shù)，在潔凈工作臺(tái)上，選用稀釋20倍的兩種浸膏稀釋液，分別為滅菌浸膏稀釋液和未滅菌浸膏稀釋液，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形菌、銅綠假單胞菌和青霉進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以無菌水做對(duì)照。通過在瓊脂平板上所形成的抑菌圈的有無，測(cè)量抑菌圈的大小進(jìn)行比較，判斷滅菌和未滅菌浸膏稀釋液是否對(duì)菌種的抑菌功效有影響，得出荔枝草是否有殺菌防霉功效。

1.4.1 培養(yǎng)基配制與接種

配制培養(yǎng)細(xì)菌需要的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和培養(yǎng)霉菌需要的PDA培養(yǎng)基，分裝錐形瓶中，加塞、包扎、滅菌后倒平板。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形菌、銅綠假單胞菌活化成液體菌種分別接入牛肉膏蛋白胨瓊脂平板中，涂布均勻。青霉接種到PDA瓊脂平板中，涂布均勻。

1.4.2 浸膏稀釋液的制備

為檢驗(yàn)滅菌對(duì)浸膏的抑菌效果有無影響，將浸膏制成兩種稀釋液：未滅菌的浸膏稀釋液和滅菌的浸膏稀釋液。

（1）未滅菌浸膏稀釋液：取荔枝草浸膏1 g，加入20 mL無菌水，制成1∶20的稀釋液，裝入錐形瓶中備用。

（2）滅菌浸膏稀釋液：取荔枝草浸膏1 g，加入20 mL無菌水，制成1∶20的稀釋液，裝入錐形瓶中，在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min取出備用。

1.4.3 抑菌活性試驗(yàn)

用無菌鑷子將3個(gè)牛津杯分別置于接種過菌種的平板上，每個(gè)牛津杯中加入20 μL的未滅菌浸膏稀釋液，每種菌種做3組平行，結(jié)果取平均值。同樣的方法用進(jìn)行已滅菌浸膏稀釋液的抑菌活性試驗(yàn)，無菌水做對(duì)照，做好標(biāo)記。將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，32 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察牛津杯周圍抑菌圈的有無及大小，用刻度尺測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)荔枝草浸膏提取和抑菌試驗(yàn)的方法步驟，記錄數(shù)據(jù)結(jié)果，然后對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.1 浸膏提取結(jié)果與分析

采用不同因素水平做正交試驗(yàn)，根據(jù)得到的浸膏含量，確定提取有效成分的最佳方案。正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

根據(jù)表3正交試驗(yàn)結(jié)果，由極差R和方差D（x）分析得出，影響荔枝草有效成分提取的主次因素順序?yàn)锽＞C＞A，即乙醇添加量對(duì)荔枝草有效成分的提取影響最大，其次是回流時(shí)間，相對(duì)來說，乙醇濃度對(duì)荔枝草有效成分的提取影響最小。同一因素不同水平的試驗(yàn)結(jié)果和方差表明，在進(jìn)行荔枝草有效成分的提取工藝中，最佳提取組合條件為A2B2C3，即乙醇濃度為70%，乙醇添加量為150 mL，回流時(shí)間為2 h。既達(dá)到最佳提取效率，又減少乙醇溶劑的用量，節(jié)約成本，所得浸膏得率在30%以上，為開發(fā)荔枝草有效成分的提取工藝提供依據(jù)。

觀察濾液顏色時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的乙醇溶液所得到的提取溶液顏色有所不同。乙醇濃度為95%時(shí)，提取液溶解較多葉綠素呈現(xiàn)綠色；乙醇濃度為70%時(shí)，提取液呈黃綠色；而乙醇濃度為50%時(shí)，提取液呈黃色透明溶液。由此推斷出乙醇含量較高時(shí)，提取液浸出大量葉綠素以及其他油溶性雜質(zhì)。

2.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析

分別用滅菌浸膏稀釋液和未滅菌浸膏稀釋液，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形菌、銅綠假單胞菌和青霉進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，無菌水做對(duì)照，測(cè)量其抑菌圈的直徑，結(jié)果如表4所示。

表4 荔枝草提取物對(duì)不同菌種的平均抑菌圈直徑表

由表4抑菌圈的大小可以判斷荔枝草提取物的抑菌功效，結(jié)果表明，荔枝草提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌功效較好，平均抑菌圈直徑較大；對(duì)普通變形菌、銅綠假單胞菌的抑菌功效基本相同，平均抑菌圈直徑小于前者；對(duì)青霉幾乎沒有抑菌功效。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)選用醇提法對(duì)荔枝草有效成分進(jìn)行提取，乙醇作為溶劑對(duì)各種化學(xué)成分的溶解度較高，提取成分全面，可提取揮發(fā)油、葉綠素、生物堿等物質(zhì)，所得提取液黏度小，易過濾，濃縮方便。由荔枝草的醇提法得率的結(jié)果比較得出：10 g荔枝草以70%的乙醇溶液150 mL，回流2 h，得率最高。影響荔枝草有效成分提取物的主要因素是乙醇添加量，其次是回流時(shí)間，相對(duì)來說乙醇濃度的影響較小。

抑菌圈試驗(yàn)法是一種常用檢測(cè)抗菌活性的方法，該方法具有經(jīng)濟(jì)、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。研究表明荔枝草的乙醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形菌、銅綠假單胞菌等常見細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抗菌活性，其中，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有良好的抑制作用，相比較而言，對(duì)普通變形菌、銅綠假單胞菌的抑制作用較弱，對(duì)常見的青霉沒有抑制作用。選用滅菌浸膏稀釋液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的目的，是因?yàn)楦邷乜赡軙?huì)破壞某些成分，影響抑菌效果，兩者作為對(duì)照更具說服力。事實(shí)證明，滅菌與未滅菌的浸膏稀釋液所形成的抑菌圈大小基本相同，說明兩者對(duì)菌種的抑制作用相差不大，易揮發(fā)物質(zhì)的損失并沒有減少對(duì)菌種的抑制活性。

如今人們的疾病防控觀念正悄然改變，更加注重“治未病”和養(yǎng)生保健，功能性食品和保健食品的需求日益增大，功能性食品正迎來黃金發(fā)展期。本試驗(yàn)結(jié)果為荔枝草相關(guān)功能性食品的進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。提取荔枝草有效成分，加工制作荔枝草茶飲料、清喉利咽口香糖等功能性食品，可以進(jìn)一步發(fā)揮荔枝草的應(yīng)用價(jià)值，有廣闊的市場(chǎng)需求。