戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心力衰竭心肌細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建及鑒定

劉云璐,王承龍,王 強(qiáng),楊 靜

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100089;2.國(guó)家中醫(yī)心血管臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100089;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100010)

心力衰竭(心衰)是威脅全球人類健康最主要的疾病之一[1-3]。心衰可由任何導(dǎo)致的心內(nèi)壓升高或心輸出量減少的心臟疾病引起[3]。心肌梗死被認(rèn)為是導(dǎo)致心衰的主要原因。心肌細(xì)胞的緩慢持續(xù)的損傷和死亡，是導(dǎo)致進(jìn)行性心功能不全的主要病理生理機(jī)制[4]。因此，了解心肌細(xì)胞損傷死亡的機(jī)制，對(duì)預(yù)防心衰具有重要性。目前，心衰的機(jī)制研究包括心肌細(xì)胞死亡、線粒體功能異常[5]、鈣調(diào)控失調(diào)、心肌纖維化和心肌肥大等方面[6-8]。明確心肌細(xì)胞損傷模型形成的機(jī)制，對(duì)心衰的基礎(chǔ)研究進(jìn)展，具有重要意義[7]。

戊巴比妥鈉對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在廣泛的抑制作用，故研究中常作為動(dòng)物基礎(chǔ)麻醉藥[8]。然其對(duì)心臟也具有較大的副作用，可嚴(yán)重抑制心肌收縮功能導(dǎo)致心衰。其損傷機(jī)制除線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激之外，還與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等環(huán)節(jié)密切相關(guān)[3,9]，因此戊巴比妥鈉可作為制作體外心力衰竭模型的藥物[10]。目前，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷死亡的機(jī)制尚不十分明確，本實(shí)驗(yàn)通過電鏡下直觀地觀察心肌細(xì)胞、亞細(xì)胞、凋亡狀態(tài)的改變，明確戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)(H9c2細(xì)胞)細(xì)胞損傷死亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 戊巴比妥鈉粉末(美國(guó)SIGMA公司，貨號(hào)57-33-0)，國(guó)產(chǎn)DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號(hào)C11995500BT)，胎牛血清(Gibco公司，貨號(hào)10100147)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，貨號(hào)25200272)，青鏈霉素混合液(Gibco公司，貨號(hào)15140122)，PBS緩沖液(索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P1020)，活性氧(ROS)試劑盒(美國(guó)SIGMA公司，貨號(hào)MAK114)，三磷酸腺苷(ATP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A095-2-1)，戊二醛溶液(美國(guó)SIGMA公司，貨號(hào)G5882)，RIPA組織/細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)S3568)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：H9c2細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心)，培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中(37 ℃、5%CO2)。待細(xì)胞生長(zhǎng)成熟，狀態(tài)穩(wěn)定后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型：無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基溶解戊巴比妥鈉粉末，混勻后配置成0.4%、0.8%、1.6%戊巴比妥鈉溶液。加至生長(zhǎng)H9c2心肌細(xì)胞的六孔板中，分別作用0、7、10 min。實(shí)驗(yàn)最終確定，0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細(xì)胞7 min，為心肌細(xì)胞損傷模型最佳條件。

1.2.3 透射電鏡觀察H9c2細(xì)胞線粒體、自噬小體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化：低倍鏡下(德國(guó)Leica倒置顯微鏡)觀察H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。透射電鏡(日本HITACHI投射電子顯微鏡)觀察H9c2細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。0.25%EDTA的胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，PBS潤(rùn)洗2次，離心，加入2%戊二醛，4 ℃固定過夜。PBS漂洗，1%鋨酸固定，1%醋酸鈾塊染，梯度丙酮脫水，包埋液包埋固化，半薄切片及甲苯胺藍(lán)染色，LKB-V超薄切片機(jī)超薄切片。透射電鏡下觀察H9c2細(xì)胞線粒體自噬小體形態(tài)及數(shù)量改變。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)H9c2細(xì)胞增殖活力： H9c2心肌細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，100 μl/孔完全培養(yǎng)基，每組6復(fù)孔。隔夜培養(yǎng)后，戊巴比妥鈉干預(yù)7 min，24 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。每孔10 μl CCK-8，90 μl完全培養(yǎng)基，避光37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2～4 h。酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)OD值，計(jì)算H9c2細(xì)胞增殖活力。

1.2.5 H9c2細(xì)胞ATP、ROS含量變化:ATP試劑盒通過蟲熒光素酶法，檢測(cè)H9c2細(xì)胞ATP濃度。棄去6孔板原有培養(yǎng)基，加入200 μl/孔裂解液，移液槍反復(fù)吹打，晃動(dòng)6孔板，使裂解液充分接觸并裂解細(xì)胞。4 ℃、12000 g離心5 min，取上清。加100 μl酶工作液至檢測(cè)管，室溫放置3～5 min，消耗掉本底全部ATP。細(xì)胞上清20 μl/檢測(cè)管孔，微量移液槍迅速混勻，間隔2 s以上，液閃儀測(cè)定RLU值。

ROS熒光探針標(biāo)記H9c2細(xì)胞中ROS。H9c2細(xì)胞1×104/cm2于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h后，0.8%戊巴比妥鈉處理7 min，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，0.25%胰蛋白酶消化，吹打。1000 r/min離心5 min，棄上清。無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA，1∶1000)，重懸H9c2細(xì)胞團(tuán)；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，每隔5 min混勻1次。基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞3次，每次1000 r/min離心5 min，熒光顯微鏡檢測(cè)強(qiáng)熒光產(chǎn)物2’,7’-二氯熒光素(2’,7’-Dichlorofluorescein,DCF)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡改變:不含EDTA胰蛋白酶消化H9c2細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，4 ℃預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，250 μl結(jié)合緩沖液(去離子水1∶10稀釋)重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)H9c2細(xì)胞濃度為1×106/ml。5 ml流式管100 μl細(xì)胞懸液中，加入Annexin V-FITC和10 μl碘化丙錠溶液各5 μl，混勻，室溫避光孵育15 min，反應(yīng)管中加400 μl PBS，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細(xì)胞7 min為構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型最佳條件 低倍鏡下，H9c2細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，0%(對(duì)照組)，0.4%、0.8%、1.6%戊巴比妥鈉分別處理H9c2細(xì)胞0、7、10 min。倒置顯微鏡下觀察H9c2細(xì)胞，原本梭形的細(xì)胞兩端變細(xì)中部變圓，有脫壁傾向，心肌細(xì)胞搏動(dòng)停止，則為造模成功。0.8%戊巴比妥鈉處理7 min的H9c2細(xì)胞符合模型條件。

圖1 光鏡比較不同條件下，戊巴比妥鈉作用于H9c2心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(甲苯胺藍(lán)染色，×100)

2.2 透射電鏡下觀察H9c2細(xì)胞線粒體、自噬小體等超微結(jié)構(gòu)改變 見圖2，對(duì)照組(無(wú)戊巴比妥鈉處理)，H9c2細(xì)胞線粒體邊界清楚，基質(zhì)均勻，線粒體嵴致密，形態(tài)正常。模型組(0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細(xì)胞7 min)，H9c2細(xì)胞線粒體邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解，少數(shù)出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，可見空泡樣變。與對(duì)照組H9c2細(xì)胞相比，模型組H9c2細(xì)胞線粒體腫脹，自噬小體的數(shù)量明顯增多，形成大量空泡，線粒體膜的完整性受到破壞(圖3)。

圖2 透射電鏡比較對(duì)照組和模型組H9c2心肌細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)變化(甲苯胺藍(lán)染色，×30000)

圖3 透射電鏡比較對(duì)照組和模型組H9c2心肌細(xì)胞中自噬小體的生成(甲苯胺藍(lán)染色，×3000)

2.3 H9c2細(xì)胞中ATP、ROS的改變 與對(duì)照組[(1.707±0.022)nmol/mg ATP]相比，模型組[(0.044±0.003)nmol/mg]ATP含量顯著減少(P<0.01)。ROS熒光探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，相比對(duì)照組，模型組DCF熒光明顯增強(qiáng)(圖4)。DCF熒光強(qiáng)弱與線粒體ROS活性成正相關(guān)，實(shí)驗(yàn)顯示，模型組ROS水平明顯增加。

圖4 熒光顯微鏡下，對(duì)照組與模型組H9c2細(xì)胞中ROS(紅色熒光)表達(dá)水平(甲苯胺藍(lán)染色，×200)

2.4 H9c2心肌細(xì)胞凋亡的改變 對(duì)照組凋亡H9c2細(xì)胞(4.8%±1.04%)比模型組(7.1%±2.43%)H9c2細(xì)胞凋亡率有增加趨勢(shì)，比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。如圖5所示，相比對(duì)照組，模型組凋亡H9c2細(xì)胞增加，死亡H9c2細(xì)胞明顯增加。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)比較對(duì)照組和模型組H9c2細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量

3 討 論

我們的實(shí)驗(yàn)探索了戊巴比妥鈉在不同藥物濃度及作用時(shí)間下，對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)、亞細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、ATP、ROS、凋亡等方面的影響，從而誘導(dǎo)心衰的機(jī)制[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，戊巴比妥鈉使H9c2細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能受損，下降A(chǔ)TP、ROS水平，使自噬小體及凋亡細(xì)胞增加。從而使H9c2心肌細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化，繼而心肌細(xì)胞搏動(dòng)停止，從而導(dǎo)致心衰。

心衰的機(jī)制被認(rèn)為與線粒體能量代謝相關(guān)，心臟僅約占體重的5%，卻占ATP消耗量的18%[12-13]，戊巴比妥鈉被報(bào)道明顯抑制心肌細(xì)胞線粒體鉀通道[4,13]，從而損傷心肌細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)由電鏡直接觀察戊巴比妥鈉對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損傷，并定量證明戊巴比妥鈉降低心肌細(xì)胞的ATP含量[14]。同樣，戊巴比妥鈉曾被報(bào)道降低心臟的左心室壓和左室收縮壓，減慢心率，抑制心肌細(xì)胞縮短幅度，降低心肌細(xì)胞的存活率[15]，抑制心臟肌層的線粒體ATP酶活性[16]。這些發(fā)現(xiàn)與我們的ATP實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

戊巴比妥鈉對(duì)凋亡的作用已被報(bào)道[8,17-19]，但對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡作用尚未報(bào)導(dǎo)。我們實(shí)驗(yàn)表明，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡。戊巴比妥鈉對(duì)自噬作用尚未報(bào)道，我們從電鏡下觀察到戊巴比妥鈉促進(jìn)H9c2細(xì)胞自噬小體生成，為戊巴比妥鈉在凋亡方面的作用提供證據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心衰相關(guān)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，并明確了戊巴比妥鈉對(duì)H9c2細(xì)胞形態(tài)、線粒體形態(tài)、ATP能量消耗、ROS氧化應(yīng)激、凋亡、自噬方面的作用。但為得到更確切的研究結(jié)論，尚需更進(jìn)一步詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)。