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    戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心力衰竭心肌細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建及鑒定

    2022-01-21 11:43:06劉云璐王承龍
    陜西醫(yī)學(xué)雜志 2022年1期
    關(guān)鍵詞:巴比妥鈉貨號(hào)心肌細(xì)胞

    劉云璐,王承龍,王 強(qiáng),楊 靜

    (1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100089;2.國(guó)家中醫(yī)心血管臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100089;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院,北京 100102;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100010)

    心力衰竭(心衰)是威脅全球人類健康最主要的疾病之一[1-3]。心衰可由任何導(dǎo)致的心內(nèi)壓升高或心輸出量減少的心臟疾病引起[3]。心肌梗死被認(rèn)為是導(dǎo)致心衰的主要原因。心肌細(xì)胞的緩慢持續(xù)的損傷和死亡,是導(dǎo)致進(jìn)行性心功能不全的主要病理生理機(jī)制[4]。因此,了解心肌細(xì)胞損傷死亡的機(jī)制,對(duì)預(yù)防心衰具有重要性。目前,心衰的機(jī)制研究包括心肌細(xì)胞死亡、線粒體功能異常[5]、鈣調(diào)控失調(diào)、心肌纖維化和心肌肥大等方面[6-8]。明確心肌細(xì)胞損傷模型形成的機(jī)制,對(duì)心衰的基礎(chǔ)研究進(jìn)展,具有重要意義[7]。

    戊巴比妥鈉對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在廣泛的抑制作用,故研究中常作為動(dòng)物基礎(chǔ)麻醉藥[8]。然其對(duì)心臟也具有較大的副作用,可嚴(yán)重抑制心肌收縮功能導(dǎo)致心衰。其損傷機(jī)制除線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激之外,還與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等環(huán)節(jié)密切相關(guān)[3,9],因此戊巴比妥鈉可作為制作體外心力衰竭模型的藥物[10]。目前,戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷死亡的機(jī)制尚不十分明確,本實(shí)驗(yàn)通過電鏡下直觀地觀察心肌細(xì)胞、亞細(xì)胞、凋亡狀態(tài)的改變,明確戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)(H9c2細(xì)胞)細(xì)胞損傷死亡的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 戊巴比妥鈉粉末(美國(guó)SIGMA公司,貨號(hào)57-33-0),國(guó)產(chǎn)DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco公司,貨號(hào)C11995500BT),胎牛血清(Gibco公司,貨號(hào)10100147),0.25%胰蛋白酶(Gibco公司,貨號(hào)25200272),青鏈霉素混合液(Gibco公司,貨號(hào)15140122),PBS緩沖液(索萊寶科技有限公司,貨號(hào)P1020),活性氧(ROS)試劑盒(美國(guó)SIGMA公司,貨號(hào)MAK114),三磷酸腺苷(ATP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A095-2-1),戊二醛溶液(美國(guó)SIGMA公司,貨號(hào)G5882),RIPA組織/細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)S3568)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):H9c2細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心),培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中(37 ℃、5%CO2)。待細(xì)胞生長(zhǎng)成熟,狀態(tài)穩(wěn)定后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型:無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基溶解戊巴比妥鈉粉末,混勻后配置成0.4%、0.8%、1.6%戊巴比妥鈉溶液。加至生長(zhǎng)H9c2心肌細(xì)胞的六孔板中,分別作用0、7、10 min。實(shí)驗(yàn)最終確定,0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細(xì)胞7 min,為心肌細(xì)胞損傷模型最佳條件。

    1.2.3 透射電鏡觀察H9c2細(xì)胞線粒體、自噬小體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:低倍鏡下(德國(guó)Leica倒置顯微鏡)觀察H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。透射電鏡(日本HITACHI投射電子顯微鏡)觀察H9c2細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。0.25%EDTA的胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞,PBS潤(rùn)洗2次,離心,加入2%戊二醛,4 ℃固定過夜。PBS漂洗,1%鋨酸固定,1%醋酸鈾塊染,梯度丙酮脫水,包埋液包埋固化,半薄切片及甲苯胺藍(lán)染色,LKB-V超薄切片機(jī)超薄切片。透射電鏡下觀察H9c2細(xì)胞線粒體自噬小體形態(tài)及數(shù)量改變。

    1.2.4 CCK-8法檢測(cè)H9c2細(xì)胞增殖活力: H9c2心肌細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,100 μl/孔完全培養(yǎng)基,每組6復(fù)孔。隔夜培養(yǎng)后,戊巴比妥鈉干預(yù)7 min,24 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。每孔10 μl CCK-8,90 μl完全培養(yǎng)基,避光37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2~4 h。酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)OD值,計(jì)算H9c2細(xì)胞增殖活力。

    1.2.5 H9c2細(xì)胞ATP、ROS含量變化:ATP試劑盒通過蟲熒光素酶法,檢測(cè)H9c2細(xì)胞ATP濃度。棄去6孔板原有培養(yǎng)基,加入200 μl/孔裂解液,移液槍反復(fù)吹打,晃動(dòng)6孔板,使裂解液充分接觸并裂解細(xì)胞。4 ℃、12000 g離心5 min,取上清。加100 μl酶工作液至檢測(cè)管,室溫放置3~5 min,消耗掉本底全部ATP。細(xì)胞上清20 μl/檢測(cè)管孔,微量移液槍迅速混勻,間隔2 s以上,液閃儀測(cè)定RLU值。

    ROS熒光探針標(biāo)記H9c2細(xì)胞中ROS。H9c2細(xì)胞1×104/cm2于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h后,0.8%戊巴比妥鈉處理7 min,加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基,PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次,0.25%胰蛋白酶消化,吹打。1000 r/min離心5 min,棄上清。無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA,1∶1000),重懸H9c2細(xì)胞團(tuán);37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min,每隔5 min混勻1次。基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞3次,每次1000 r/min離心5 min,熒光顯微鏡檢測(cè)強(qiáng)熒光產(chǎn)物2’,7’-二氯熒光素(2’,7’-Dichlorofluorescein,DCF)。

    1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡改變:不含EDTA胰蛋白酶消化H9c2細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,4 ℃預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次,250 μl結(jié)合緩沖液(去離子水1∶10稀釋)重懸細(xì)胞,調(diào)節(jié)H9c2細(xì)胞濃度為1×106/ml。5 ml流式管100 μl細(xì)胞懸液中,加入Annexin V-FITC和10 μl碘化丙錠溶液各5 μl,混勻,室溫避光孵育15 min,反應(yīng)管中加400 μl PBS,1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    2 結(jié) 果

    2.1 0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細(xì)胞7 min為構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型最佳條件 低倍鏡下,H9c2細(xì)胞形態(tài)如圖1所示,0%(對(duì)照組),0.4%、0.8%、1.6%戊巴比妥鈉分別處理H9c2細(xì)胞0、7、10 min。倒置顯微鏡下觀察H9c2細(xì)胞,原本梭形的細(xì)胞兩端變細(xì)中部變圓,有脫壁傾向,心肌細(xì)胞搏動(dòng)停止,則為造模成功。0.8%戊巴比妥鈉處理7 min的H9c2細(xì)胞符合模型條件。

    圖1 光鏡比較不同條件下,戊巴比妥鈉作用于H9c2心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(甲苯胺藍(lán)染色,×100)

    2.2 透射電鏡下觀察H9c2細(xì)胞線粒體、自噬小體等超微結(jié)構(gòu)改變 見圖2,對(duì)照組(無(wú)戊巴比妥鈉處理),H9c2細(xì)胞線粒體邊界清楚,基質(zhì)均勻,線粒體嵴致密,形態(tài)正常。模型組(0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細(xì)胞7 min),H9c2細(xì)胞線粒體邊界模糊不清,體積明顯腫脹,基質(zhì)密度降低,部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解,少數(shù)出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象,可見空泡樣變。與對(duì)照組H9c2細(xì)胞相比,模型組H9c2細(xì)胞線粒體腫脹,自噬小體的數(shù)量明顯增多,形成大量空泡,線粒體膜的完整性受到破壞(圖3)。

    圖2 透射電鏡比較對(duì)照組和模型組H9c2心肌細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)變化(甲苯胺藍(lán)染色,×30000)

    圖3 透射電鏡比較對(duì)照組和模型組H9c2心肌細(xì)胞中自噬小體的生成(甲苯胺藍(lán)染色,×3000)

    2.3 H9c2細(xì)胞中ATP、ROS的改變 與對(duì)照組[(1.707±0.022)nmol/mg ATP]相比,模型組[(0.044±0.003)nmol/mg]ATP含量顯著減少(P<0.01)。ROS熒光探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示,相比對(duì)照組,模型組DCF熒光明顯增強(qiáng)(圖4)。DCF熒光強(qiáng)弱與線粒體ROS活性成正相關(guān),實(shí)驗(yàn)顯示,模型組ROS水平明顯增加。

    圖4 熒光顯微鏡下,對(duì)照組與模型組H9c2細(xì)胞中ROS(紅色熒光)表達(dá)水平(甲苯胺藍(lán)染色,×200)

    2.4 H9c2心肌細(xì)胞凋亡的改變 對(duì)照組凋亡H9c2細(xì)胞(4.8%±1.04%)比模型組(7.1%±2.43%)H9c2細(xì)胞凋亡率有增加趨勢(shì),比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。如圖5所示,相比對(duì)照組,模型組凋亡H9c2細(xì)胞增加,死亡H9c2細(xì)胞明顯增加。

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)比較對(duì)照組和模型組H9c2細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量

    3 討 論

    我們的實(shí)驗(yàn)探索了戊巴比妥鈉在不同藥物濃度及作用時(shí)間下,對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)、亞細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、ATP、ROS、凋亡等方面的影響,從而誘導(dǎo)心衰的機(jī)制[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,戊巴比妥鈉使H9c2細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能受損,下降A(chǔ)TP、ROS水平,使自噬小體及凋亡細(xì)胞增加。從而使H9c2心肌細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化,繼而心肌細(xì)胞搏動(dòng)停止,從而導(dǎo)致心衰。

    心衰的機(jī)制被認(rèn)為與線粒體能量代謝相關(guān),心臟僅約占體重的5%,卻占ATP消耗量的18%[12-13],戊巴比妥鈉被報(bào)道明顯抑制心肌細(xì)胞線粒體鉀通道[4,13],從而損傷心肌細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)由電鏡直接觀察戊巴比妥鈉對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損傷,并定量證明戊巴比妥鈉降低心肌細(xì)胞的ATP含量[14]。同樣,戊巴比妥鈉曾被報(bào)道降低心臟的左心室壓和左室收縮壓,減慢心率,抑制心肌細(xì)胞縮短幅度,降低心肌細(xì)胞的存活率[15],抑制心臟肌層的線粒體ATP酶活性[16]。這些發(fā)現(xiàn)與我們的ATP實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

    戊巴比妥鈉對(duì)凋亡的作用已被報(bào)道[8,17-19],但對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡作用尚未報(bào)導(dǎo)。我們實(shí)驗(yàn)表明,戊巴比妥鈉誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡。戊巴比妥鈉對(duì)自噬作用尚未報(bào)道,我們從電鏡下觀察到戊巴比妥鈉促進(jìn)H9c2細(xì)胞自噬小體生成,為戊巴比妥鈉在凋亡方面的作用提供證據(jù)。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心衰相關(guān)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷模型,并明確了戊巴比妥鈉對(duì)H9c2細(xì)胞形態(tài)、線粒體形態(tài)、ATP能量消耗、ROS氧化應(yīng)激、凋亡、自噬方面的作用。但為得到更確切的研究結(jié)論,尚需更進(jìn)一步詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)。

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