植物激素調(diào)控OsBLR1基因促進(jìn)水稻萌發(fā)的機(jī)制分析

常彥鵬，耿梓宸，王坤，李夢(mèng)琪，張博，趙文麗

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100089；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 南京 210000)

植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程主要包括幼苗期、分蘗期、抽穗期和結(jié)實(shí)期4個(gè)時(shí)期。幼苗期的種子萌發(fā)是水稻生長(zhǎng)階段的起始，種子休眠是種子在合適的生長(zhǎng)環(huán)境下依然不能萌發(fā)的現(xiàn)象[1-4]。影響種子休眠與萌發(fā)的因素很多，分為外在因素和內(nèi)在因素。外在因素包括外界環(huán)境光照、溫度、濕度等[5-7]；內(nèi)在因素主要是種子成熟度、α-淀粉酶活性、內(nèi)源植物激素的含量及比例等[8-9]。植物激素是影響種子休眠和萌發(fā)的重要因素之一，多種激素共同調(diào)控種子休眠和萌發(fā)過(guò)程。研究表明，在種子休眠和萌發(fā)過(guò)程中起主要作用的激素是脫落酸ABA和赤霉素GA[10-11]。ABA誘導(dǎo)種子休眠，抑制種子萌發(fā)。GA與ABA的作用相反[12-13]。GA在解除種子休眠和促進(jìn)種子萌發(fā)中起著重要作用，GA的合成是打破種子休眠狀態(tài)的必要條件之一[14]。

bHLH (basic helix-loop-helix) 轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，具有重要的功能，因其保守的bHLH結(jié)構(gòu)域而得名[15]。研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫及合成代謝等生物過(guò)程的調(diào)控[16]。擬南芥中，PIF (bHLH轉(zhuǎn)錄因子) 作為光信號(hào)負(fù)調(diào)控因子參與phyA/phyB下游基因的表達(dá)調(diào)控，最終抑制種子萌發(fā)[17-18]。紅光和遠(yuǎn)紅光信號(hào)通過(guò)蛋白酶體降解PIF3-1ike 5 (PIL5，bHLH轉(zhuǎn)錄因子) 促進(jìn)種子萌發(fā)[19]。擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子SPATULA是種子萌發(fā)的光穩(wěn)定阻遏物[20]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，水稻中一個(gè)典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsBLR1(Os02g0705500)，參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，OsBLR1-OE株系表型為葉夾角增大且籽粒變長(zhǎng)，對(duì)外源BR更為敏感[21]。

目前，關(guān)于bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控種子萌發(fā)的報(bào)道并不多，并且OsBLR1是否參與調(diào)控萌發(fā)過(guò)程尚不明確。本研究以O(shè)sBLR1-OE (OsBLR1-overexpression)轉(zhuǎn)基因株系為研究材料，分析GA3和ABA對(duì)OsBLR1轉(zhuǎn)錄的影響，并測(cè)定OsBLR1-OE萌發(fā)過(guò)程中GA3和ABA的含量，利用qRT-PCR試驗(yàn)分析GA和ABA通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄變化，旨在初步探索GA和ABA調(diào)控OsBLR1促進(jìn)水稻種子萌發(fā)的機(jī)制，并為bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控萌發(fā)提供新的試驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

日本晴(Nip，OryzasativaL.ssp.japonicacv.)和OsBLR1-OE株系，均為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲(chóng)生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所有。

1.2 方法

1.2.1 水稻常規(guī)培養(yǎng) 將水稻種子浸于體積分?jǐn)?shù)10%的H2O2溶液中消毒10 min，用清水沖洗5～6次。將消毒后的種子浸入適量水中，黑暗環(huán)境下30 ℃萌發(fā)1～2 d。萌發(fā)后的種子點(diǎn)于96孔培養(yǎng)穴中，于恒溫氣候箱中培養(yǎng)，條件為相對(duì)濕度60%，28 ℃光照16 h，25 ℃黑暗8 h。

1.2.2 表型鑒定及分析 將開(kāi)始浸種的時(shí)間標(biāo)記為0 h，在浸種24 h后，將種子放入含有清水的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，浸種后第1～5天每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)和第5天種子根長(zhǎng)。第5天幼苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用普通相機(jī)進(jìn)行表型拍攝。

1.2.3 ABA和GA3激素處理 將Nip種子點(diǎn)種后置于恒溫培養(yǎng)箱中水培，正常生長(zhǎng)至14 d，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行激素處理。脫落酸(ABA)(20 μmol·L-1)、赤霉素(GA3)(10 μmol·L-1)溶液均勻噴灑至葉片表面或加入培養(yǎng)液中，在處理后 0、3、6、12和24 h取葉片或根，用于RNA提取和熒光定量PCR試驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)程序如表1所示。熒光定量數(shù)據(jù)分析利用公式:R= 2[ΔCt sample-ΔCt control]，R為相對(duì)表達(dá)水平，ΔCtsample為試驗(yàn)組中基因Ct值與內(nèi)參β-actinCt值的差值，ΔCtcontrol為對(duì)照組中基因Ct值與內(nèi)參β-actinCt值的差值。試驗(yàn)包含3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR所用引物如表2所示。利用Turkey test 進(jìn)行組間差異分析。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 1 qRT-PCR system

1.2.4 GA3和ABA激素含量測(cè)定 選取不同株系浸種后24 h的水稻種子，取完整種子作為樣品(> 2 g)于液氮速凍后研缽中磨碎，然后溶解于1.5 mL 體積分?jǐn)?shù)80%甲醇水溶液中，4 ℃浸提過(guò)夜。隨后采用液相色譜技術(shù)(HPLC)對(duì)樣品內(nèi)源ABA和GA3進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定試驗(yàn)由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司完成(科銘，蘇州，中國(guó))。

1.2.5 Nip和OsBLR1-OE吸脹萌發(fā)時(shí)基因表達(dá)差異分析 將Nip和OsBLR1-OE種子浸種24 h后，分別將種子用液氮研磨后，進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。相關(guān)基因引物序列參見(jiàn)表2。

表2 熒光定量PCR所用引物及序列Table 2 Primers and sequences used in qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 OsBLR1基因?qū)λ痉N子萌發(fā)速率的影響

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，Nip和OsBLR1-OE株系種子在第3天開(kāi)始萌發(fā)，OsBLR1-OE萌發(fā)率顯著高于Nip且第4天時(shí)萌發(fā)率達(dá)到100%，Nip種子在第5天時(shí)萌發(fā)率達(dá)到100%(圖1-A)。并且，OsBLR1-OE的發(fā)芽勢(shì)顯著高于Nip(圖1-B)。對(duì)Nip和OsBLR1-OE浸種萌發(fā)5 d時(shí)的表型進(jìn)行拍照和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，OsBLR1-OE根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于Nip(圖1-C和圖1-D)。以上結(jié)果表明，OsBLR1-OE比Nip萌發(fā)速度快。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示同一處理下不同株系間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase betters in the figure indicate significant differences between different lines under the same treatment (P<0.05)．The same as below.圖1 Nip和OsBLR1-OE在種子發(fā)芽率(A)、發(fā)芽勢(shì)(B)、萌發(fā)情況(C)和根長(zhǎng)(D)中的差異Fig.1 Differences between Nip and OsBLR1-OE in seed germination rate (A),germination potential (B),germination status (C) and root length (D)

2.2 外源ABA和GA3對(duì)OsBLR1基因轉(zhuǎn)錄的影響

外源激素ABA和GA3處理后，OsBLR1轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。葉片中，OsBLR1的表達(dá)在ABA處理1、3、6和24 h分別顯著上調(diào)2.04、5.96、3.13和2.75倍；OsBLR1的表達(dá)在GA3處理6、12和24 h分別顯著上調(diào)1.68、1.39和1.39倍(圖2-A和2-B)。根中，OsBLR1的表達(dá)在ABA處理1， 3， 6，12和24 h分別顯著上調(diào)2.12、8.41、2.39、4.42和6.07倍；OsBLR1的表達(dá)在GA3處理3和12 h分別顯著上調(diào)1.41和2.61倍(圖2-C和2-D)。

圖2 ABA和GA3對(duì)葉片中OsBLR1轉(zhuǎn)錄(A和B)和根中OsBLR1轉(zhuǎn)錄(C和D)的影響Fig.2 Effects of ABA and GA3 on the transcripts of OsBLR1 in the leaves (A and B) and the roots (C and D)

2.3 OsBLR1基因?qū)?nèi)源激素ABA和GA3含量的影響

內(nèi)源ABA和GA3激素含量測(cè)定結(jié)果顯示，OsBLR1-OE中內(nèi)源ABA含量顯著低于Nip 18.21%(圖3-A)，內(nèi)源GA3含量顯著高于Nip 19.84%(圖3-B)，GA3與ABA比值顯著高于Nip 1.44倍(圖3-C)。

圖3 不同株系中ABA含量(A)、GA3含量(B)和GA3/ABA比值(C)Fig.3 ABA content (A),GA3 content (B) and GA3/ABA ratio (C) in different lines

2.4 OsBLR1基因?qū)A和ABA信號(hào)通路基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，OsBLR1-OE中，ABA 生物合成的關(guān)鍵酶OsNCED3基因表達(dá)量顯著低于Nip 67.83%(圖4-A)；涉及脫落酸和高滲透?jìng)鲗?dǎo)的OsSAPK3基因表達(dá)量顯著低于Nip 31.58%(圖4-B)；脫落酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsDG1基因表達(dá)量顯著低于Nip 24.81%(圖4-C)；GA合成通路基因GA20氧化酶OsGA20ox1和赤霉素20-氧化酶OsGA20ox3基因表達(dá)量分別顯著高于Nip 141.18%和237.06%(圖4-D和圖4-E)；GA失活基因赤霉素2-β-雙加氧酶OsGA2ox3基因表達(dá)量顯著低于Nip 39.58%(圖4-F)。

圖4 不同株系中OsNCED3基因表達(dá)量(A)、OsSARK3基因表達(dá)量(B)、OsDG1基因表達(dá)量(C)、OsGA20ox1基因表達(dá)量(D)、OsGA20ox3基因表達(dá)量(E)和OsGA2ox3基因表達(dá)量(F)Fig.4 OsNCED3 gene expression (A),OsSARK3 gene expression (B),OsDG1 gene expression (C),OsGA20ox1 gene expression (D),OsGA20ox3 gene expression (E),and OsGA2ox3 gene expression (F) in different lines

3 結(jié)論與討論

汪德州等[22]認(rèn)為，玉米ZmbHLH4基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)可促進(jìn)擬南芥種子萌發(fā)，且影響形態(tài)建成。SHI等[23]認(rèn)為，擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子HFR1抑制種子萌發(fā)。上述研究表明，在不同物種中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子影響種子萌發(fā)。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子OsBLR1促進(jìn)種子萌發(fā)與以上研究結(jié)果相符合。

種子萌發(fā)過(guò)程與ABA 和 GA 的變化密切相關(guān)。ABA誘導(dǎo)種子休眠和維持種子吸脹休眠狀態(tài)[24]。在萌發(fā)完成前(種子吸水第2階段的后期)，ABA的含量是種子能否完成萌發(fā)的決定性因素[25]。GA具有破除種子休眠和促進(jìn)種子萌發(fā)功能，是種子萌發(fā)的激活因子[26]。ABA含量多或GA含量少導(dǎo)致多數(shù)種子處于休眠狀態(tài)，相反，ABA含量少或GA 含量多解除種子休眠利于種子萌發(fā)[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA 和 GA3均顯著上調(diào)OsBLR1基因的表達(dá)量，OsBLR1-OE株系中，ABA含量低于Nip，GA3含量高于Nip，且GA3與ABA含量比值顯著高于Nip。因此，推測(cè)OsBLR1-OE中GA3和ABA含量變化是導(dǎo)致其種子萌發(fā)速度加快的原因。

植物中多種基因參與ABA的生物合成，9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是ABA 生物合成的關(guān)鍵酶[29-31]。蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶(SnRK2)通過(guò)修飾C端產(chǎn)生ABA應(yīng)答能力[32]。脫落酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DG1)是外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，具有脫落酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，介導(dǎo)ABA長(zhǎng)距離運(yùn)輸[33]。GA2ox、GA3ox和GA20ox是GA合成的關(guān)鍵基因[34-38]。GA20ox在花生和列當(dāng)種子萌發(fā)過(guò)程中表達(dá)顯著上調(diào)[39-40]。在黃芪種子萌發(fā)時(shí)，GA2ox基因表達(dá)上調(diào)，GA20ox基因表達(dá)下調(diào)。外源GA3處理華重樓萌發(fā)種子時(shí)，GA2ox基因表達(dá)下調(diào)，GA20ox基因表達(dá)上調(diào)[41-42]。本研究發(fā)現(xiàn)，OsBLR1-OE株系中，OsNCED3、OsSAPK3和OsDG1基因表達(dá)量顯著低于Nip，且GA合通路基因OsGA20ox1和OsGA20ox3基因表達(dá)顯著上調(diào)，而GA失活基因OsGA2ox3基因表達(dá)量顯著低于Nip。結(jié)合上述基因的轉(zhuǎn)錄變化，我們推測(cè)OsBLR1-OE種子萌發(fā)時(shí)，上述基因的轉(zhuǎn)錄變化導(dǎo)致內(nèi)源ABA含量下降，GA含量增多。

綜上所述，OsBLR1轉(zhuǎn)錄水平受GA3和ABA影響而上調(diào)，OsBLR1-OE株系中ABA合成和運(yùn)輸通路相關(guān)基因表達(dá)量降低，GA合成通路相關(guān)基因表達(dá)量升高，且GA活性的負(fù)反饋抑制減弱，導(dǎo)致ABA含量下降，GA合成增多且活性不受抑制，GA/ABA比值增大，最終促進(jìn)種子萌發(fā)。