基于逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(shù)的蘋果病毒新型快速檢測方法

焦健，夏炎，武雪莉，王苗苗，宋春暉，龐宏光，白團輝，宋尚偉，黃松,2，鄭先波

(1.河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，河南 鄭州，450002； 2.信陽農(nóng)林學院，河南 信陽，464006)

蘋果(Malusdomestica)是中國種植面積最大，產(chǎn)量最高的果樹樹種之一，具有較高的經(jīng)濟價值[1-2]，但蘋果生長中很容易發(fā)生由病毒和類病毒引起的病害[3]。目前世界上報道的蘋果病毒病有39種，包括非潛隱性病毒25種，潛隱性病毒14種[4-5]，其中蘋果壞死花葉病毒(apple mosaic virus，ApNMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒(apple stem pitting virus，ASPV)、蘋果莖溝病毒(apple stem grooving virus，ASGV)、蘋果銹果類病毒(apple scar skin viroid，ASSVd)在中國發(fā)生較為普遍[6]。蘋果病毒病已成為制約蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要生物因素，病毒侵入樹體后會在樹體內(nèi)迅速增殖，使其終生帶毒，不僅影響果樹正常的生理代謝和生長，而且會導致果實品質(zhì)和產(chǎn)量的下降[7]。

蘋果樹主要通過無性繁殖，樹體一旦感病，將終生帶毒[8]，因此要想盡可能降低、避免病毒病造成的損失，只能通過繁殖無病毒種植材料以及在植物生長階段的早期進行病毒檢測并及時處理感病植株，以避免產(chǎn)量的損失，防止病毒病的進一步傳播[9]。因此，特異性強、靈敏度高、準確快速的蘋果病毒檢測體系十分重要。隨著分子病毒學和生物技術(shù)的進步，如今有許多方法已應用于植物病毒的檢測：指示植物法、酶聯(lián)免疫法、電鏡觀測法、核酸分子雜交法[10-13]、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)和新一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)[14-16]，但大多數(shù)分子檢測方法都存在操作復雜、設備要求高、檢測時間過長等缺陷。

重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種新型的等溫核酸擴增和檢測技術(shù)，由英國TwistDx Inc公司于2006年成功開發(fā)[17]。其主要依賴于重組酶(recombinase)、鏈置換DNA聚合酶(polymerase)和單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA-binding protein)的酶促反應[18]：首先兩條引物先與重組酶蛋白形成穩(wěn)定的復合物；該復合物能夠侵入靶標dsDNA，并將引物導向同源序列；隨后在37～42 ℃的條件下通過DNA聚合酶催化鏈置換、合成、連續(xù)擴增[19]。與PCR熱變性不同的是，RPA利用酶促混合物進行DNA變性，因此在等溫條件下即可完成擴增反應。此外，在常規(guī)RPA體系中可加入逆轉(zhuǎn)錄酶，開發(fā)出逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(shù)(reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA)。RT-RPA以RNA為檢測底物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進行擴增，就可實現(xiàn)RNA的一步法擴增，從而能夠更加方便快捷的進行RNA病毒檢測。

RT-RPA操作簡單、靈敏度高、擴增效率高、在相對較低的恒溫(25～43 ℃)下持續(xù)5～20 min即可完成擴增反應[20]，近兩年備受關(guān)注。目前關(guān)于植物病毒的RPA檢測方法在黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、玉米褪綠斑駁病毒、山藥花葉病毒、番茄斑駁病毒、馬鈴薯Y病毒、番茄黃葉卷曲病毒和玫瑰花環(huán)病毒等[21-26]已有報道。KIM等[27]也根據(jù)蘋果莖溝病毒的CP基因高保守區(qū)域設計出了能夠靈敏快速檢測該病毒的RPA引物，但是，此引物是以梨中分離出ASGV病毒進行設計的。此外，蘋果其他的病毒病如ASPV、ACLSV以及近年來最新報道的蘋果花葉病的主要病原物ApNMV，還未建立其RT-RPA檢測體系。

本研究以蘋果病毒ASGV、ASPV、ACLSV和ApNMV為主要研究對象，利用逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(shù)，建立RT-RPA新型快速檢測方法，為蘋果病毒病的早期快速診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院河南省果樹瓜類分子生物學重點實驗室完成。試驗材料采集地點為河南農(nóng)業(yè)大學毛莊科教園區(qū)果樹實驗站蘋果資源圃，從不同品種的蘋果樹上采集20份葉片有明顯病癥的蘋果葉片樣品，采集時間為2020年8月。采集后的樣品帶回實驗室后放于-80 ℃冰箱貯藏用于后續(xù)試驗。

1.2 引物設計

下載NCBI數(shù)據(jù)庫中病毒全長序列，利用MEGA-X軟件[28]進行比對分析，找尋病毒保守區(qū)域。隨后參照RPA等溫擴增試劑盒TwistAmpbasic kit(Twist DX，United Kingdom)的要求，采用NCBI在線引物設計工具Primer-BLAST，設計檢測ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV的引物(表1)，并由生工生物(上海，中國)合成。RPA引物設計原則如下：(1)在保守區(qū)域設計引物，長度30～35 bp，GC含量20%～70%，單堿基重復序列<5；(2)RPA擴增產(chǎn)物長度為100～200 bp；(3)引物序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(nr/nt)進行Blast比對，確保其種內(nèi)保守性和種間特異性。

1.3 RNA提取與RT-RPA反應

將采集的蘋果葉片置于液氮中冷凍后研磨成粉末，使用植物總RNA提取試劑盒DP432(北京，天根)提取總RNA，隨后使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計Nanodrop 2000(Thermo，USA)分別檢驗RNA的完整性和質(zhì)量濃度(ng·μL-1)。

RT-RPA反應體系參照TwistAmp?basic試劑盒(Twist DX，United Kingdom)說明書，按照上下游引物各2.5 μL、2.5 μL HiScript III reverse Transcriptase(200 U·μL-1)，2.5 μL RNase inhibitor(40 U·μL-1)，rehydration buffer 29.5 μL、RNase-free水7 μL、總RNA 1.0 μL配置RT-RPA反應預混液，將47.5 μL預混液轉(zhuǎn)移至反應沉淀中。通過上下移液混合，直到整個顆粒重新懸浮，37 ℃孵育5 min進行逆轉(zhuǎn)錄反應；隨后在反應管蓋子上加入2.5 μL醋酸鎂，渦旋后離心；42 ℃溫育20～30 min。反應產(chǎn)物使用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 反應體系優(yōu)化

以10 ng·μL-1植物總RNA為模板，反應體系及步驟參照1.3中RT-RPA反應體系，反應溫度分別設定為20、25、30、35、37、39、42、45及50 ℃進行RT-RPA擴增以確定RT-RPA最佳反應溫度，在最佳溫度下將反應時間分別設定為1、5、10、15、20、25及30 min進行RT-RPA擴增以確定RT-RPA最佳反應時間。反應結(jié)束后將5 μL擴增產(chǎn)物加入10 μL SDS loading buffer(5%甘油，10 mmol·μL-1EDTA，0.01%溴酚藍和0.25% SDS)中，在質(zhì)量分數(shù)為2%瓊脂糖凝膠上進行電泳并觀察結(jié)果。

1.5 RNA轉(zhuǎn)錄本制備與靈敏度檢測

以感病蘋果葉片的cDNA為模板，利用表1中的RPA特異性引物，進行PCR擴增。將4種蘋果病毒的擴增產(chǎn)物純化后，克隆到pGEM-T質(zhì)粒(Promega)并進行測序驗證。隨后使用pUC/M13通用引物(M13pUC-Fwd，5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′；M13pUC-Rev，5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)擴增出包含T7啟動子序列的病毒dsDNA片段。將上述PCR產(chǎn)物稀釋至100 ng·μL-1，使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit(New England Biolabs)，分別合成4種病毒的RNA片段。隨后采用RNA純化試劑盒(北京，天根)對體外轉(zhuǎn)錄的RNA進行純化，使用NanoDrop 2000分光光度計測量其濃度，并轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)?？截悢?shù)的計算方法[29]：

拷貝數(shù)(copies·μL-1)=

以4種病毒片段的RNA轉(zhuǎn)錄本為模板，以9.63×109copies·μL-1為初始濃度，以10為倍數(shù)依次進行稀釋，同時設置陰性對照，分別進行RT-RPA和RT-PCR擴增反應，RT-PCR反應體系為2×Taq酶25 μL，RPA-F、R引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，cDNA 2 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水補足至50 μL，RT-RPA擴增方法及體系參照1.3。RT-RPA和RT-PCR擴增產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為2 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察結(jié)果。

1.6 RPA引物特異性分析

分別挑選ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV復合侵染不同類型的蘋果葉片為材料，使用RT-PCR法和特異性引物(表1)對4對RPA引物進行特異性分析，反應體系參照1.5中RT-PCR反應體系。此外，其他幾種蘋果中常見病毒病，如ASSVd(NCBI登錄號EU031466)，ApMV(RNAs 1-3，NCBI登錄號NC003464，NC003465和NC003480)以及李壞死環(huán)斑病毒(prunus necrotic ring spot virus，PNRSV；RNAs 1-3，NCBI登錄號NC004362，NC004363和NC004364)，人工合成后(南京，金斯瑞)作為底物，進行RPA擴增特異性分析，‘嘎啦’蘋果脫毒苗的cDNA(CK)作為陰性對照。

表1 蘋果病毒檢測所用引物Table 1 Primers used to detect apple viruses

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-RPA反應體系優(yōu)化

首先對RT-RPA反應的時間和溫度進行優(yōu)化。相同反應時間，在15～50 ℃區(qū)間進行RT-RPA反應，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。當RPA反應溫度高于25 ℃時，開始有少量擴增；35～43 ℃時，擴增效果無明顯差異；25 ℃以下以及50 ℃以上，無擴增。由于要兼顧逆轉(zhuǎn)錄反應時所推薦的最佳溫度(37 ℃)，綜合考慮，本試驗選擇37 ℃為RT-RPA最適反應溫度。

M：DNA marker(bp)；A：蘋果莖溝病毒；B：蘋果壞死花葉病毒；C：蘋果褪綠葉斑病毒；D：蘋果莖痘病毒；N：陰性對照。M：DNA marker(bp)；A：ASGV；B：ApNMV；C：ACLSV；D：ASPV；N：Negative control.圖1 不同反應溫度對4種蘋果病毒RPA擴增的影響Fig.1 Effect of different reaction temperatures on RPA amplification of four apple viruses

隨后在37 ℃條件下，優(yōu)化RT-RPA反應時間，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。反應在10 min后，開始有可觀測到的擴增條帶；反應時間在20～30 min時，擴增效果較好。因此，本試驗將30 min作為最適宜反應時間。綜上，最終確定在37 ℃條件下，反應時間為30 min時，RT-RPA反應可達到有效的目標病毒片段擴增。

M：DNA marker(bp)；A：蘋果莖溝病毒；B：蘋果壞死花葉病毒；C：蘋果褪綠葉斑病毒；D：蘋果莖痘病毒；N：陰性對照。M：DNA marker(bp)；A：ASGV；B：ApNMV；C：ACLSV；D：ASPV；N：Negative control.圖2 不同反應時間對4種蘋果病毒RPA擴增的影響Fig.2 Effect of different reaction time on RPA amplification of four apple viruses

2.2 RT-RPA靈敏度檢測

靈敏度檢測結(jié)果如圖3所示，4種蘋果病毒的RT-RPA檢測靈敏度下限均為9.63×101copies，遠高于RT-PCR檢測靈敏度，其中ACLSV和ASPV的RT-RPA檢測靈敏度比RT-PCR檢測靈敏度高100倍，而ASGV、ApNMV的RT-RPA檢測靈敏度比RT-PCR檢測靈敏度高1 000倍。

M：DNA marker(bp)；N：陰性對照。M：DNA marker(bp)；N：Negative control.圖3 4種蘋果病毒的RT-PCR(A)與RT-RPA(B)檢測靈敏度比對Fig.3 Comparison of detection sensitivity for four apple viruses between RT-PCR(A)and RT-RPA(B)

2.3 RT-RPA引物特異性分析

由于自然樣本中，蘋果病毒多為復合侵染，在使用RT-RPA檢測病毒之前，事先采用RT-PCR技術(shù)對田間樣本的病毒進行檢測，挑選出不同的病毒復合感染類型葉片。隨后以不同病毒感染類型的蘋果葉片cDNA以及人工合成的ASSVd、ApMV和PNRSV病毒為模板，對ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV 4種蘋果病毒的RT-RPA引物特異性進行檢測。結(jié)果顯示，4對蘋果病毒的RPA引物均能夠準確檢測出該病毒，與RT-PCR檢測結(jié)果一致，未出現(xiàn)非特異性擴增(圖4)。證明所設計的RPA引物特異性良好，能夠?qū)Ｒ徊《具M行檢測。

M：DNA marker(bp)；A：ASPV檢測；B：ASGV檢測；C：ACLSV檢測；D：ApNMV檢測；CK：空白對照；√：陽性；×：陰性。M：DNA marker(bp)；A：Detection of ASPV；B：Detection of ASGV；C：Detection of ACLSV；D：Detection of ApNMV；√：Positive；×：Negative.圖4 4種蘋果病毒RPA引物特異性檢測Fig.4 Specific detection of RPA primers of four apple viruses

3 結(jié)論與討論

目前，植物病毒診斷大多基于PCR法，這就需要將樣品運送到專業(yè)機構(gòu)通過大型、昂貴的儀器進行檢測，并且PCR技術(shù)往往依賴高質(zhì)量的核酸提取，這就使得整個檢測流程過于復雜。RPA技術(shù)不需要高質(zhì)量的模板，其反應條件簡單，不需要復雜的變溫儀器，通過合理的特異性引物設計，即可在常溫下進行靶標病毒檢測[34-36]。本研究針對ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV 這4種病毒，設計了特異性的RPA擴增引物，通過對溫度、反應時間以及檢測靈敏度等方面的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了特異性強，靈敏度高的RT-RPA新型快速檢測方法，能夠適用于在條件簡陋的情況下快速檢測蘋果病毒。

在反應時間上，本研究采用的RT-RPA技術(shù)比常規(guī)RT-PCR在檢測時間上縮短了1 h；在靈敏度上，RT-RPA比RT-PCR高102～103倍；在反應溫度上，37 ℃條件下即可很好地進行擴增。這表明RPA擴增技術(shù)可以很好檢測低濃度病毒載量，在病毒感染初期或者苗木病毒檢測中，具有明顯的優(yōu)勢，隨著該技術(shù)的廣泛應用可以完美替代RT-PCR檢測。此外，RPA反應組分以凍干粉末的形式提供，這提高了檢測試劑的穩(wěn)定性，使得該過程易于遵循，并防止檢測被污染。

目前，采用RPA技術(shù)檢測蘋果病毒病的研究相對較少，KIM等[27]根據(jù)梨樹中ASGV病毒分離物的CP區(qū)域設計出了能夠檢測ASGV的RPA引物，但經(jīng)過序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該引物設計區(qū)域保守性較差，可能無法滿足變異ASGV病毒的檢測。本研究針對ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV 4種病毒，通過不同病毒分離物的序列比對，設計出了特異性RPA引物，可以滿足這4種病毒的特異性檢測，效果顯著。雖然本研究采用的是瓊脂糖電泳檢測陽性結(jié)果，但設計的引物也可以結(jié)合側(cè)向流動試紙條或者熒光檢測技術(shù)進行應用。

綜上所述，RT-RPA有可能在田間直接進行病毒檢測，有助于及時根除感病植株，從而最大限度地降低病毒傳播相關(guān)的風險。鑒于RT-RPA檢測技術(shù)的準確性和實用性，建議進一步加大RT-RPA技術(shù)在蘋果病毒檢測方面的研發(fā)。