馬鈴薯白酒固態(tài)釀造中酵母的 種群結(jié)構(gòu)及多樣性分析

◎ 任妍菱，林 巧，吳 兵，劉軍華，李家怡，陳 瑤，鄧友勝，陳亦然，祝藝嘉

（1.攀西特色作物研究與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 西昌 615000；2.涼山州天美益農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 西昌 615000）

馬鈴薯也被叫作荷蘭薯、洋芋等，是我國重要農(nóng)作物之一，營養(yǎng)豐富，富含維生素、淀粉、蛋白質(zhì)等，所以又把馬鈴薯叫作“地下蘋果”與“第二面包”[1]。馬鈴薯的糊化性很好，可以作為原材料釀造白酒。涼山州盛產(chǎn)馬鈴薯，但由于交通不便，許多馬鈴薯滯銷腐爛，因此本試驗(yàn)中以馬鈴薯、玉米為原料，釀造出馬鈴薯白酒，合理開發(fā)與利用馬鈴薯資源的同時(shí)，也拓大馬鈴薯產(chǎn)品的加工市場[2]。

高通量測序是目前真菌多樣性研究的主要技術(shù)，具有信息量大、重復(fù)性好、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)[3]。將高通量測序技術(shù)用于馬鈴薯白酒發(fā)酵酒醅中的微生物結(jié)構(gòu)分析中，通過處理測序數(shù)據(jù)，可以對(duì)馬鈴薯白酒酒醅中發(fā)揮主要作用的酵母種類和真菌菌落的組成取得整體性認(rèn)識(shí)，了解馬鈴薯白酒酒醅中主要微生物在釀造過程中的組成差異，從而為馬鈴薯白酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯、玉米、高粱、WL培養(yǎng)基、酒曲、糖化酶、白砂糖和麩皮等。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海英衡電子秤有限公司；壓力蒸氣滅菌器，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；303電熱恒溫培養(yǎng)箱，聯(lián)鯨科技有限公司設(shè)備；Illumina HiSeq 2500測序平臺(tái)試驗(yàn)方法。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

馬鈴薯白酒釀造工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.3.2 采樣位點(diǎn)

樣品來自實(shí)驗(yàn)室馬鈴薯白酒釀造酒醅，共12個(gè)采樣時(shí)間，分別為：第一次發(fā)酵第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d和11 d（樣品分別標(biāo)號(hào)為Fday1、Fday3、Fday5、Fday7、Fday9、Fday11），第二次發(fā)酵第1 d、3 d、 5 d、7 d、9 d和11 d樣品分別標(biāo)號(hào)為Sday1、Sdays3、 Sday5、Sday7、Sday9、Sday11），采樣位置為發(fā)酵缸的中上層。

1.3.3 高通量測序分析方法

百邁客生物科技有限公司利用Illumina HiSeq高通量測序平臺(tái)測序。用檢測后的合格的基因組DNA稀釋后作為模板，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和熒光定量，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)檎婢腎TS1區(qū)，構(gòu)建HiSeq文庫并進(jìn)行雙端測序，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序。通過對(duì)Reads進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾[4]，得到優(yōu)化序列后，進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。

采用Usearch[5]進(jìn)行可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類分析[6]，對(duì)于相似性水平≥97%的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)，其中每個(gè)OTU代表一個(gè)物種。采用樸素貝葉斯分類器對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析[7]，在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)樣本群落的組成。利用QIIME2軟件計(jì)算樣本的α多樣性，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage值，以表征真菌群落的豐富度和多樣性。采用QIIME軟件計(jì)算樣本β多樣性距離矩陣，使用非加權(quán)組平均法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)處理與分析

質(zhì)量通過Illumina HiSeq高通量測序，12份酒醅樣品質(zhì)構(gòu)后得到了共獲得1015 352對(duì)Reads，雙端Reads質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生862350條Clean Reads，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生59122 條Clean Reads，平均產(chǎn)生71863 條Clean Reads。平均長度250～280 bp，按照97%相似性，分別聚成27～50個(gè)可操作分類單元（OTUs），見圖2。

2.2 酒醅菌群的OTU數(shù)圖

通常情況下，把相似性＞97%的序列分為同一個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一種物種。把樣品分析聚類后得出各個(gè)樣品的OTU數(shù)圖，如圖2所示。柱子上面的數(shù)字即為相應(yīng)樣品的OTU數(shù)目。由圖2可知，酵母豐度在整個(gè)酒醅發(fā)酵期間波動(dòng)較大，大茬的波動(dòng)強(qiáng)度明顯大于二茬，并且二茬的豐富度明顯大于大茬，且在二茬樣品11中真菌種類是最多的，說明馬鈴薯白酒在釀造過程中，其酒醅中的真菌在發(fā)酵初期變化趨勢較大，后期較為平穩(wěn)且種類最多。

圖2 ITS測序的OTU數(shù)圖

2.3 物種注釋及分類學(xué)分析

樣品的豐度比較低，將低豐度的OUT處理掉后，根據(jù)得到的OTU總計(jì)出每個(gè)樣品中各等級(jí)能夠得到的tags數(shù)，再計(jì)算出在各分類水平下，物種類型在每個(gè)樣品中的數(shù)目，如表1所示。由表1可知：①在大茬酒醅中的微生物種類隨著發(fā)酵的進(jìn)行，有先增多、后減少，到中后期又增加的趨勢，但個(gè)別樣品中的酵母種類數(shù)出現(xiàn)異常，可能是在攪拌或取樣時(shí)，由于操作不當(dāng)，將環(huán)境中的外來微生物也帶入其中參與發(fā)酵。②在二茬酒醅中的微生物種類先增多后趨于 穩(wěn)定。

表1 測序的各等級(jí)中的物種數(shù)表

2.4 馬鈴薯白酒酒醅測序結(jié)果及α多樣性分析

通過樣本的多樣性分析（Alpha多樣性）可以反映微生物群落的豐度和多樣性[8]，Chao1指數(shù)是用Chaol算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可以用來指代菌群的豐度，辛普森（Simpson）指數(shù)和香農(nóng)Shannon）指數(shù)都是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高[9]。Coverage是指樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，該指數(shù)能反映出測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。由表2可知，每個(gè)樣品的Coverage值均為0.999以上[10]，表明測序深度良好，覆蓋 率高[11]。

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表

其中，第一次發(fā)酵時(shí)的各樣品的Chao1指數(shù)總體上低于第二次發(fā)酵的各樣品的Chao1指數(shù)，且前者指數(shù)變化上下波動(dòng)較大，說明兩次發(fā)酵中真菌菌落豐富度存在差異性變化，真菌種類后者高于前者。各樣品的Shannon指數(shù)表明，在第一次發(fā)酵過程中，數(shù)值波動(dòng)較大，真菌的多樣性變化不穩(wěn)定，在第二次發(fā)酵過程中，數(shù)值波動(dòng)變化不大，說明真菌的多樣性變化趨于平穩(wěn)，且比對(duì)兩次發(fā)酵，后者的數(shù)值除去Sday3以外其他的值均大于前者，說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅中的真菌群落多樣性逐漸增高；Simpson指數(shù)越大，優(yōu)勢度物種越小，Sday11突增，優(yōu)勢度物種降低。造成這種現(xiàn)象的原因有可能在大茬階段真菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較弱，里面的微生物都在大量繁殖，真菌的變化較為明顯，二茬階段時(shí)，真菌群落的豐富度和多樣性又有所提高，推測可能是有些真菌逐漸適應(yīng)了缺氧高酒精的環(huán)境，綜上所述，大茬和二茬在真菌群落豐富度上度差異較大，且二茬真菌群落多樣性遠(yuǎn)高于大茬。

2.5 酒醅真菌群落在綱、目、科、屬、種水平上的組成和相對(duì)豐度

綱水平上，除未分類和其他真菌以外，其中Saccharomycetes（酵母綱）占比最高，其次是Eurotiomycetes（散囊菌綱）。在第一次發(fā)酵過程中，Eurotiomycetes豐度總體呈下降趨勢，在第二次發(fā)酵過程，Eurotiomycetes（散囊菌綱）豐度先升高后又降低，且在二茬的末期，除去未分類菌外，Leohumicola（錘苔舌菌）成為第三多的屬種。從上述結(jié)果可以看出，不同樣品真菌的優(yōu)勢綱種類相同，但各優(yōu)勢綱在不同樣品中真菌總量的占比并不相同，且發(fā)酵末期真菌綱種類增加。

目水平上，除去未分類和其他真菌，其中Saccharomycetes（酵母綱目）占比最高，其次是Eurotiomycetes（散囊菌目）。在第一次發(fā)酵過程中，Eurotiomycetes（散囊菌目）豐度總體呈下降趨勢，在第二次發(fā)酵過程，Eurotiomycetes（散囊菌目）豐度先升高后又降低，其他的真菌占比幾乎很小，優(yōu)勢菌依然是Saccharomycetes（酵母目）。

科水平上，12中樣品中占比前10的可歸類真菌綱依次為Pha☆omycetaceae（法夫酵母科）、Aspergillaceae（曲霉科）、Archaeorhizomycetaceae、Rhizopodaceae、Bolbitiaceae（糞銹傘科）、Cladosporiaceae（枝孢霉科）、Lasiosphaeriaceae（毛球殼科）、Hypocreaceae（肉座菌科）、Didymosphaeriaceae（隔孢球殼科）和Meruliaceae（皺皮菌科）。除去未分類和其他真菌來說，Pha☆omycetaceae（法夫酵母科）相對(duì)豐度可以達(dá)到82%～99%，占比最高，其次是Aspergillaceae（曲霉科），其他真菌科的占比都較低。

從屬水平上看，除去未分類和其他真菌來說，其中Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母）占比最高，其次是Aspergillus（曲霉），而且Aspergillus（曲霉）豐度總體呈下降趨勢。在第一次發(fā)酵過程中，前期氧氣充足，Wickerhamomuces（異常威克漢姆酵母）和Aspergillus（曲霉）都有利于生長繁殖，到了后期氧氣稀薄，Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母）能有利的在無氧條件下產(chǎn)生酒精。對(duì)曲霉的生長也有一定的抑制作用；在第二次發(fā)酵過程中，第11天的Leohumicola（錘舌菌屬）成為第三多的屬種。

從種水平上看，除去未分類和其他真菌來說，Wickerhamomyces anomalus（異常威克漢姆酵母）含量最高，其次是Pichia myanmarensis（產(chǎn)香酵母）含量較多，為白酒發(fā)酵產(chǎn)香起了重要作用。第一次發(fā)酵過程中，總體上來說Wickerhamomyces anomalus（異常威克漢姆酵母）含量呈上升趨勢，在第二次發(fā)酵過程中，第11天出現(xiàn)Leohumicola minima（錘舌菌）含量異常增多的現(xiàn)象，從不同分類單元的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，在門、綱、目、科、屬水平的第一次發(fā)酵和第二次發(fā)酵的真菌類型大致相同，但具體占比不同。眾多研究表明，真菌的群落多樣性還取決于發(fā)酵次數(shù)且異常威克漢姆酵母和產(chǎn)香酵母酒醅發(fā)酵過程中起相對(duì)重要的作用。

2.6 不同發(fā)酵時(shí)期馬鈴薯白酒酒醅發(fā)酵液樣本真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 UPGMA分析

Beta多樣性是對(duì)不同樣品中微生物群落構(gòu)成差異的比較分析，主要關(guān)注時(shí)空環(huán)境格局相關(guān)的物種組成變化[12]。在對(duì)馬鈴薯白酒酒醅發(fā)酵液中不同分類學(xué)水平真菌菌群相對(duì)豐度進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用UPGMA分析研究不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異關(guān)系，根據(jù)β多樣性距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類分析[13]，使用UPGMA算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)[14]，如圖3所示。馬鈴薯白酒酒醅發(fā)酵液樣品可聚為3類，其中對(duì)于大茬而言：Fday1、Fday5、Fday9聚為一類，F(xiàn)day3、Fday7聚為一類，F(xiàn)day11聚為一類；對(duì)于二茬而言：Sday1、Sday5、Sday9聚為一類，Sday11聚為一類，Sday3、Sday7聚為一類。由此也可將整個(gè)發(fā)酵過程大致分為3個(gè)階段，發(fā)酵前期、中期和后期。針對(duì)于發(fā)酵時(shí)期相同的大茬、二茬的來說，真菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。從整體的發(fā)酵過程上來看，真菌群落組成結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3 基于Beta多樣性距離的樣品層級(jí)聚類樹圖

2.6.2 PCA分析

進(jìn)一步進(jìn)行PCA分析可知，主成分1（PC1）的貢獻(xiàn)率為79.02%，主成分2（PC2）的貢獻(xiàn)率為18.99%，合計(jì)為98.01%，說明兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，樣本之間的距離代表真菌群落結(jié)構(gòu)的差異程度，如圖4所示。12個(gè)樣品真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，在4個(gè)象限均有分布，且聚類趨勢不太明顯；其中Sday1和Sday5真菌群落多樣性差異較小，分布于第三象限，其菌群種類相似程度較高，且對(duì)比整體的群落結(jié)構(gòu)具有明顯的不同，這與UPGMA聚類分析大致結(jié)果 一致。

圖4 基于Beta多樣性的PCA分析圖

2.6.3 屬水平真菌群落分析

圖5表明了在馬鈴薯白酒在不同發(fā)酵時(shí)期，樣本間不同真菌菌屬的相對(duì)豐度以及真菌組成的差異性和樣品間的相似性。在二茬發(fā)酵前期（Sday1～Sday3）時(shí)Bjerkandera（黑管菌屬）為優(yōu)勢菌屬，在二茬發(fā)酵中期（Sday5～Sday7）時(shí)Fusarium（鐮刀菌屬）和Ustialaginoidea（綠核菌屬）優(yōu)勢菌屬，二茬發(fā)酵末期（Sday9～Sday11）中，Cladosporium（分支孢子菌屬）、Leohumicola（錘舌菌屬）、Archaeorhizomyces（子囊菌屬）及Phaeosphaeria（球腔菌屬），相對(duì)豐度大大提高，發(fā)展為優(yōu)勢菌屬，在大茬發(fā)酵階段真菌組成的差異性不是很大，總體上趨于低豐度。

圖5 酒醅樣品真菌屬的聚類分析圖

在整個(gè)發(fā)酵過程中，樣品可聚為3類，Sday11單獨(dú)歸為一類，F(xiàn)day3、Fday7、Fday11和Sday3、Sday7在屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)比較接近，歸為一類；Fday1， Fday5、Fday9、Sday1、Sday5和Sday9在屬水平真菌群 落結(jié)構(gòu)比較接近，歸為一類。分別對(duì)應(yīng)于二茬的發(fā)酵末期、大茬的發(fā)酵中末期和二茬的的發(fā)酵中期、大茬的發(fā)酵前期和二茬的發(fā)酵期，總豐度排名在前的可分為4類，其中Cladosporium（分支孢子菌屬）、Leohumicola（錘舌菌屬）、Archaeorhizomyces（子囊菌屬）、Trichoderma（木霉屬）及Mortierella（被孢霉屬）、Ustilaginoidea（綠核菌屬）聚為一類，對(duì)應(yīng)圖中1、2、3、4、5。在大茬、二茬的發(fā)酵前中期豐度較低，而在二茬的后期豐度較高。Bjerkandaeria（黑管菌屬）、Phaeosphaeria（球腔菌屬）聚為一類，對(duì)應(yīng)圖中6、7。在二茬發(fā)酵中末期相對(duì)豐度較高，其余時(shí)候相對(duì)豐度較低。大茬與二茬兩者相比，隨著發(fā)酵時(shí)間的延續(xù)，通過蒸酒次數(shù)的比對(duì)，可知二茬的相對(duì)豐度比大茬高，菌種后期逐步適宜環(huán)境，有利于菌種的生長繁殖。綜上，發(fā)酵次數(shù)對(duì)菌種的生長起到一定的影響。

2.7 酒醅中酵母在WL鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微鏡觀察

酵母在WL鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微鏡觀察情況如圖6所示。①平板下觀察：菌落大，整體菌群分散均勻，表面光滑，酵母外形飽滿圓潤，形態(tài)完整。有些菌落圓形凸起，有些邊緣呈放射狀，菌株顏色大多呈乳白色，少量菌株邊緣白色，中央淡綠色。②油鏡下觀察：采用呂氏美蘭染色法，在100倍顯微鏡下觀察到酵母多呈卵圓形、瓶形、圓形，單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能清晰地看見液泡等眾多細(xì)胞器，有時(shí)候會(huì)發(fā)現(xiàn)酵母的出芽生殖，可以清晰看到從菌體出的芽，在酵母的細(xì)胞膜上有細(xì)小酵母個(gè)體。

圖6 酵母在WL鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微鏡觀察圖

3 結(jié)論與討論

本文首次綜合采用WL鑒別培養(yǎng)基和利用高通量測序技術(shù)對(duì)12種酒醅樣品的16S rRNA基因18 S和5.8 S 進(jìn)行測序，該區(qū)域適用性較廣，能夠高效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，是微生物多樣性分析優(yōu)先選擇的區(qū)域之一。結(jié)果獲得了1015 352條有效序列數(shù)，并聚成27～50個(gè)OTUs，且12種酒醅樣品中真菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao指數(shù)分別在0.1282～1.2096、0.0241～0.3248和28.0～47.0，說明所測定的酒醅含有豐富的真菌種類。同時(shí)，從不同分類單元的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，12種酒醅樣品在門、綱、目、科、屬水平的優(yōu)勢真菌類型相同，具體占比不同。眾多研究表明，從大茬、二茬發(fā)酵相同階段上來說，真菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。從整體的發(fā)酵過程上來看，真菌群落組成結(jié)構(gòu)存在差異，變化趨勢明顯。

研究表明，不管從整體還是大茬、二茬分類角度分析，優(yōu)勢菌科都為法夫酵母科，優(yōu)勢菌科都為異常威克漢姆酵母（94%）。酵母菌產(chǎn)生的酯化酶作用下使乙酸和乙醇生成乙酸乙酯，提高酒的含脂量，生香味。異常威克漢姆酵母為主的產(chǎn)酯酵母對(duì)酒精的耐受性差，乙醇對(duì)異常威克漢姆酵母生長和發(fā)酵性能具有嚴(yán)重抑制作用，所以在該實(shí)驗(yàn)中異常威克漢姆酵母的相對(duì)豐度變化較大[15]。第二大優(yōu)勢菌科為生香酵母，其被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵相關(guān)領(lǐng)域，包括醬醋釀造、傳統(tǒng)面食、果酒醬發(fā)酵、白酒釀造等風(fēng)味導(dǎo)向型產(chǎn)業(yè)，起到豐富香氣、改善感官品質(zhì)的作用，具備提升酒體感官品質(zhì)的[16]。除了酵母屬在釀造過程中起發(fā)酵作用外，發(fā)現(xiàn)曲霉也具有一定的功能作用，從種水平上看，黃曲霉僅次于Wickerhamomuces anomalus（異常威克漢姆酵母）和Pichia myanmarensis（產(chǎn)香酵母）成為第3大優(yōu)勢菌種，黃曲霉產(chǎn)液化型淀粉酶的能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，并且能分解DNA產(chǎn)生核苷酸[17]。

酵母作為釀造過程中重要的生物類群，起著重要作用。由于酵母個(gè)體小、數(shù)量多，其多變的類型和強(qiáng)大的適應(yīng)環(huán)境能力，為我們了解酵母全貌帶來障礙。通過高通量測序技術(shù)可以快速直觀地得到真菌結(jié)構(gòu)并且能獲得大量未知種類，顯示出分子生物技術(shù)的優(yōu)勢，研究酒醅中酵母群落結(jié)構(gòu)及多樣性，必須將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法結(jié)合起來[18]。