水溶液中胞嘧啶陽離子自由基降解反應(yīng)機(jī)理的理論研究

吳麗丹,嚴(yán)錢錢,曾志虹,曾楠

(上饒師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001)

當(dāng)生物體中的DNA和其他生物分子暴露在內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧自由基或許多外源性的化學(xué)試劑中時(shí),它們可能被氧化性損傷,這在炎癥、癌癥等疾病的病理生理學(xué)中起重要作用[1]。外源性DNA損傷最主要的一個(gè)來源是堿基的單電子氧化,它可能發(fā)生在DNA被電離輻射或有光敏劑的過程中[2]。近20年來,人們對電離輻射損傷細(xì)胞DNA的分子機(jī)制進(jìn)行了大量研究[3－4]。越來越多的證據(jù)表明,電離輻射產(chǎn)生的DNA堿基陽離子自由基引發(fā)了各種物理和化學(xué)變化,構(gòu)成了細(xì)胞毒性DNA損傷的主要類型之一[4－5]。因此,對堿基陽離子自由基降解途徑的研究可以為理解電離輻射或化學(xué)試劑引起的DNA損傷機(jī)制提供指導(dǎo)。本文選取胞嘧啶陽離子自由基(C＋·)為研究對象,研究其在水溶液中的降解反應(yīng)。

根據(jù)電子自旋共振和脈沖射解研究,2'－脫氧胞嘧啶核苷(d C)中產(chǎn)生的C＋·在水溶液中主要經(jīng)歷從環(huán)外NH2脫質(zhì)子反應(yīng),生成的氨基自由基C(－H)·進(jìn)一步異構(gòu)化為亞氨基自由基,如圖1所示[6－7]。水合產(chǎn)物C5OH·和C6OH·非常少[6]。而在雙鏈DNA中產(chǎn)生的C＋·,其水合作用變得顯著,因?yàn)橄鄳?yīng)的穩(wěn)態(tài)產(chǎn)物顯著增加了[8]。雙鏈DNA與自由d C中產(chǎn)物產(chǎn)率的顯著差異說明C＋·的降解途徑可能具有高度的結(jié)構(gòu)依賴性。近期Wang等[9]利用時(shí)間分辨光譜研究i－Motif結(jié)構(gòu)及自由dC中C＋·的降解證實(shí)了這一點(diǎn)。i－Motif是在弱酸性條件下,通過半質(zhì)子化堿基對C(H)＋∶C的互化網(wǎng)絡(luò),由富含胞嘧啶的序列形成的一種獨(dú)特DNA二級結(jié)構(gòu)[10]。在自由dC中,C＋·主要發(fā)生脫質(zhì)子和異構(gòu)化反應(yīng),速率常數(shù)分別為1.4×107s－1、8.8×104s－1[9]。而在i－Motif結(jié)構(gòu)中,C＋·主要發(fā)生水合反應(yīng),速率常數(shù)為5.3×103s－1[9]。

圖1 C＋·降解反應(yīng)；d R為脫氧核糖

到目前為止,實(shí)驗(yàn)上對C＋·在水溶液中降解反應(yīng)的研究比較多,而且結(jié)果表明C＋·的降解途徑具有高度的結(jié)構(gòu)依賴性。理論上對C＋·在水溶液中降解反應(yīng)的研究尚沒有。因此本文將利用量子化學(xué)從理論上研究C＋·在水溶液中的降解反應(yīng)。由于C＋·的降解途徑具有高度的結(jié)構(gòu)依賴性,我們選取自由dC和i－Motif兩種結(jié)構(gòu)作為具體研究對象,因?yàn)閕－Motif結(jié)構(gòu)可以排除雙鏈DNA中鳥嘌呤堿基的干擾,期望從理論上闡明C＋·降解途徑具有結(jié)構(gòu)依賴性的原因。

1 理論計(jì)算方法

自由dC和i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·的存在形式分別為C＋·,C(H)＋∶C＋·,它們的結(jié)構(gòu)如圖2所示。運(yùn)用M062X泛函在6－31＋G(d)水平上優(yōu)化了C＋·及C(H)＋∶C＋·發(fā)生脫質(zhì)子反應(yīng)和水合反應(yīng)所涉及的反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體以及產(chǎn)物的構(gòu)型,并在同樣的條件下得到了各構(gòu)型的能量。M062X泛函被證實(shí)適合此類研究[11]。由于C(H)＋∶C＋·計(jì)算模型中包含59個(gè)原子,用比6－31＋G(d)更大的基組計(jì)算耗時(shí)太長,因此考慮到計(jì)算效率,沒有用更大的基組計(jì)算。通過頻率分析確認(rèn)了計(jì)算所得的構(gòu)型。所有的駐點(diǎn)頻率都為正值,而過渡態(tài)有唯一虛頻。此外,所有的過渡態(tài)通過內(nèi)稟反應(yīng)坐標(biāo)進(jìn)行了確認(rèn)[12]。為了考慮溶劑的影響,計(jì)算得到的能量利用連續(xù)介質(zhì)模型(PCM)進(jìn)行校正[13]。所有計(jì)算都是利用Gaussian 09程序包完成[14]。

圖2 C＋·及C(H)＋∶C＋·的結(jié)構(gòu)；dR為脫氧核糖

2 結(jié)果與討論

之前對胸腺嘧啶陽離子自由基(T＋·)脫質(zhì)子過程的研究發(fā)現(xiàn),在水溶液中釋放的質(zhì)子將被水分子穩(wěn)定形成水合質(zhì)子,因此水分子的存在對脫質(zhì)子過程有影響[11]。為了模擬C＋·在水溶液中的環(huán)境,在計(jì)算模型中加入了顯性水分子。加入的顯性水分子的數(shù)目也被證實(shí)對脫質(zhì)子過程非常重要[11]。對于C＋·,若只加入1～5個(gè)顯性水分子,脫質(zhì)子過程未能計(jì)算出。加入6個(gè)顯性水分子后,優(yōu)化出了脫質(zhì)子過程,因此計(jì)算模型為C＋·…6 H2O。而對于C(H)＋∶C＋·,由于C(H)＋與C＋·形成氫鍵,減少了C＋·周圍所需顯性水分子的數(shù)目,加入4個(gè)顯性水分子即優(yōu)化出了脫質(zhì)子過程,因此計(jì)算模型為C(H)＋∶C＋·…4H2O。

2.1 C＋·…6H 2 O脫質(zhì)子及水合反應(yīng)

C＋·脫質(zhì)子的位點(diǎn)是環(huán)外NH2,其上有2個(gè)H,分別標(biāo)為Ha、Hb,如圖2所示。在6個(gè)顯性H2O存在條件下,優(yōu)化所得C＋·脫質(zhì)子反應(yīng)所涉及的反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖3所示。C＋·首先與6個(gè)H2O通過氫鍵復(fù)合,形成反應(yīng)物RA。經(jīng)過過渡態(tài)TS1A,水分子奪取質(zhì)子Hb形成中間體IM1A。在IM1A中,圓圈圈出的即為水合質(zhì)子?？缭竭^渡態(tài)TS1A需要的能量(ΔE)為22.4 kJ/mol。中間體IM1A經(jīng)過過渡態(tài)TS2A,將剩余的Ha旋轉(zhuǎn)到原來Hb的位置,形成中間體IM2A?？缭竭^渡態(tài)TS2A需要的能量(ΔE)為32.7 kJ/mol。從反應(yīng)物RA開始,也可經(jīng)過渡態(tài)TS3A,水分子奪取質(zhì)子Ha直接形成中間體IM2A。但是跨越過渡態(tài)TS3A需要的能量(ΔE)為54.4 kJ/mol,比跨越TS1A和TS2A的能量都高。中間體IM2A中的Ha可通過過渡態(tài)TS4A轉(zhuǎn)移到N3位,形成亞氨基自由基和水合質(zhì)子的復(fù)合物,即最終的產(chǎn)物PA。TS4A為四元環(huán)過渡態(tài),在此過渡態(tài)中,Ha直接從環(huán)外N轉(zhuǎn)移給N3,跨越此過渡態(tài)需要的能量(ΔE)為190.8 kJ/mol。中間體IM2A中的Ha也可通過一分子水的幫助,經(jīng)過渡態(tài)TS5A轉(zhuǎn)移到N3位,形成最終的產(chǎn)物PA。TS5A為六元環(huán)過渡態(tài),在此過渡態(tài)中,Ha從環(huán)外N轉(zhuǎn)移給H2O,同時(shí)H2O中的一個(gè)H轉(zhuǎn)移給N3,實(shí)現(xiàn)水分子幫助的H轉(zhuǎn)移。跨越過渡態(tài)TS5A需要的能量(ΔE)為76.5 kJ/mol,比跨越TS4A需要的能量大大減少。最終的亞氨基自由基產(chǎn)物PA的能量比反應(yīng)物RA低12.2 kJ/mol,說明產(chǎn)物穩(wěn)定。而氨基自由基無論是IM1A還是IM2A都比反應(yīng)物RA能量高,說明它們不穩(wěn)定,會繼續(xù)反應(yīng)生成最終的產(chǎn)物PA。由各過渡態(tài)的能壘可以確定最終C＋·脫質(zhì)子反應(yīng)的路徑是RA→TS1A→IM1A→TS2A→IM2A→TS5A→PA,反應(yīng)的決速步是由IM2A生成產(chǎn)物PA,能壘為76.5 kJ/mol。

圖3 M062X/6－31＋G(d)方法計(jì)算得到C＋·在6個(gè)顯性H 2 O存在條件下脫質(zhì)子反應(yīng)的相對勢能曲線

C＋·與H2O可發(fā)生C5和C6加成,生成C5OH·和C6OH·。為了使水合計(jì)算條件與脫質(zhì)子一致,計(jì)算了C＋·與6個(gè)顯性H2O發(fā)生C5及C6加成的反應(yīng),所涉及的反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖4所示。發(fā)生C5加成時(shí),C＋·首先與6個(gè)H2O復(fù)合形成反應(yīng)物RB。隨后,H2O中的OH親核加成到C5原子,同時(shí)H2O中的H轉(zhuǎn)移給C6原子形成中間體IMB。此過程經(jīng)過渡態(tài)TS1B完成,需要跨越的能壘(ΔE)為215.9 kJ/mol,是整個(gè)反應(yīng)路徑的決速步驟。之后,C6上的一個(gè)質(zhì)子通過過渡態(tài)TS2B釋放到水中,形成水合質(zhì)子(圖4中圓圈所示)和C5OH·復(fù)合物,即最終的產(chǎn)物PB。跨越過渡態(tài)TS2B需要的能量(ΔE)為14.6 kJ/mol。產(chǎn)物PB的能量比反應(yīng)物RB低22.7 kJ/mol,說明產(chǎn)物穩(wěn)定。

圖4 M062X/6－31＋G(d)方法計(jì)算得到C＋·與6個(gè)顯性H 2 O發(fā)生C5及C6加成反應(yīng)的相對勢能曲線

發(fā)生C6加成時(shí),反應(yīng)物RB經(jīng)過渡態(tài)TS1C將H2O中的OH親核加成到C6原子,同時(shí)H2O中的H轉(zhuǎn)移給C5原子形成中間體IMC。此過程需要跨越的能壘(ΔE)為235.7 kJ/mol,是整個(gè)反應(yīng)路徑的決速步驟。之后,C5上的一個(gè)質(zhì)子通過過渡態(tài)TS2C釋放到水中,形成水合質(zhì)子和C6OH·復(fù)合物PC?？缭竭^渡態(tài)TS2C需要的能量(ΔE)為26.2 kJ/mol。產(chǎn)物PC的能量比反應(yīng)物RB低30.9 kJ/mol,說明產(chǎn)物穩(wěn)定。

由計(jì)算所得C＋·…6H2O脫質(zhì)子及水合反應(yīng)結(jié)果可知,C＋·脫質(zhì)子或與水發(fā)生C5、C6加成的產(chǎn)物都比相應(yīng)的反應(yīng)物能量低,反應(yīng)都放熱,熱力學(xué)表明這些反應(yīng)都能夠發(fā)生。但是C＋·脫質(zhì)子的能壘(76.5 kJ/mol)遠(yuǎn)比C＋·與水C5、C6加成的能壘(分別為215.9、235.7 kJ/mol)低,因此最有利的反應(yīng)途徑是C＋·脫質(zhì)子。即在自由dC中,C＋·主要發(fā)生脫質(zhì)子反應(yīng),與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[9]。脫質(zhì)子步驟的能壘為22.4 kJ/mol,隨后異構(gòu)化步驟的能壘為76.5 kJ/mol,計(jì)算所得此兩步能壘的相對大小與文獻(xiàn)中所測反應(yīng)速率常數(shù)的相對大小也一致[9]。

為了考慮溶劑水對各路徑影響,利用PCM對計(jì)算得到的能量進(jìn)行了校正。各路徑的能壘都降低了,C＋·脫質(zhì)子的能壘變?yōu)?8.4 kJ/mol,降低了8.1 kJ/mol;C＋·與水C5、C6加成的能壘分別變?yōu)?90.2、234.8 kJ/mol,分別降低了25.7、0.9 kJ/mol?？紤]溶劑水后,自由d C中C＋·仍然主要發(fā)生脫質(zhì)子反應(yīng)。

2.2 C(H)＋∶C＋·…4H 2 O脫質(zhì)子及水合反應(yīng)

在C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中,C＋·環(huán)外NH2中的Hb與C(H)＋的O形成了氫鍵(如圖2所示),導(dǎo)致Hb不能釋放到水溶劑中,因此C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·脫質(zhì)子的位點(diǎn)為Ha。在4個(gè)顯性H2O存在條件下,優(yōu)化所得C(H)＋∶C＋·脫質(zhì)子反應(yīng)所涉及的反應(yīng)物、過渡態(tài)及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖5所示。C(H)＋∶C＋·首先與4個(gè)H2O復(fù)合形成反應(yīng)物RD。經(jīng)過過渡態(tài)TSD,水分子奪取C＋·的質(zhì)子Ha形成氨基自由基與水合質(zhì)子,此氨基自由基依然與C(H)＋通過3個(gè)氫鍵形成配合物,即產(chǎn)物PD。在PD中圓圈圈出的即為水合質(zhì)子?？缭竭^渡態(tài)TSD需要的能量(ΔE)為35.4 kJ/mol。在PD結(jié)構(gòu)中,由于氨基自由基的Hb、N3分別與C(H)＋的O、N3 H形成了氫鍵,由氨基自由基異構(gòu)化為亞氨基自由基的過程被抑制,因此PD即為最終的產(chǎn)物。它的能量比反應(yīng)物RD高17.6 kJ/mol,說明PD不穩(wěn)定,容易沿著反應(yīng)途徑逆向變回反應(yīng)物RD。

圖5 M062X/6－31＋G(d)方法計(jì)算得到C(H)＋∶C＋·在4個(gè)顯性H 2 O存在條件下脫質(zhì)子反應(yīng)的相對勢能曲線

C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·與H2O也可發(fā)生C5和C6加成,生成C5OH·和C6OH·。C(H)＋∶C＋·與4個(gè)顯性H2O發(fā)生C5及C6加成反應(yīng)所涉及的反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖6所示。反應(yīng)的過程與C＋·中類似,都是H2O中的OH先加成到C＋·的C5(C5加成)或C6(C6加成)原子,同時(shí)H2O中的H轉(zhuǎn)移給C6(C5加成)或C5(C6加成)原子,之后C6(C5加成)或C5(C6加成)上的一個(gè)質(zhì)子釋放到水中形成最終產(chǎn)物。在C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中,C5加成兩步的能壘分別為183.7、15.3 kJ/mol;C6加成兩步的能壘分別為212.3、92.4 kJ/mol,整個(gè)反應(yīng)路徑的決速步驟也都是第一步。因此C(H)＋的存在對C＋·水合反應(yīng)的機(jī)理無影響。生成的產(chǎn)物也都穩(wěn)定,其中PE的能量比反應(yīng)物RE低8.2 kJ/mol,PF的能量比反應(yīng)物RE低20.2 kJ/mol。

圖6 M062X/6－31＋G(d)方法計(jì)算得到C(H)＋∶C＋·錢瑛(2015)與4個(gè)顯性H 2 O發(fā)生C5及C6加成反應(yīng)的相對勢能曲線

由計(jì)算所得C(H)＋∶C＋·…4H2O脫質(zhì)子及水合反應(yīng)結(jié)果可知,C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·脫質(zhì)子的產(chǎn)物不穩(wěn)定,與水發(fā)生C5、C6加成的產(chǎn)物都相對穩(wěn)定。因此,即使C＋·脫質(zhì)子的能壘最低(35.4 kJ/mol),C＋·脫質(zhì)子反應(yīng)也不能發(fā)生,因?yàn)樯傻拿撡|(zhì)子產(chǎn)物會沿著反應(yīng)途徑逆向變回反應(yīng)物,相當(dāng)于反應(yīng)沒有發(fā)生。C＋·與水C5、C6加成的能壘(分別為183.7、212.3 kJ/mol)雖相對較高,但因其為唯二可發(fā)生的反應(yīng),因此C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中最有利的反應(yīng)途徑是C＋·水合。即在i－Motif結(jié)構(gòu)中,C＋·主要發(fā)生水合反應(yīng),與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[9]。在C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·水合的能壘(183.7 kJ/mol)比C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·脫質(zhì)子(22.4 kJ/mol)和異構(gòu)化(76.5 kJ/mol)的能壘高,因此C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·水合的反應(yīng)速率應(yīng)當(dāng)是最慢的,這與文獻(xiàn)所測的反應(yīng)速率常數(shù)相對大小一致[9]。

為了考慮溶劑水對各路徑影響,利用PCM對計(jì)算得到的能量進(jìn)行了校正。各路徑的能壘都降低了,C(H)＋∶C＋·結(jié)構(gòu)中C＋·脫質(zhì)子的能壘變?yōu)?4.5 kJ/mol,降低了0.9 kJ/mol;C＋·與水C5、C6加成的能壘分別變?yōu)?65.9、200.4 kJ/mol,分別降低了17.8、11.9 kJ/mol。各路徑產(chǎn)物的能量也有變化,但穩(wěn)定性沒有改變:脫質(zhì)子的產(chǎn)物依然不穩(wěn)定,而C5、C6加成的產(chǎn)物都穩(wěn)定?？紤]溶劑水后,i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·仍然主要發(fā)生水合反應(yīng)。

3 結(jié)論

通過M062X/6－31＋G(d)水平上的計(jì)算研究發(fā)現(xiàn),在自由dC中C＋·主要發(fā)生脫質(zhì)子反應(yīng),且脫質(zhì)子產(chǎn)物并不穩(wěn)定,會通過異構(gòu)化生成穩(wěn)定產(chǎn)物;而在i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·主要發(fā)生水合反應(yīng)。i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·水合反應(yīng)的能壘(183.7 kJ/mol)比自由d C中C＋·脫質(zhì)子(22.4 kJ/mol)和異構(gòu)化(76.5 kJ/mol)的能壘高,因此i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·水合反應(yīng)的速率慢于自由dC中C＋·脫質(zhì)子和異構(gòu)化。i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·脫質(zhì)子反應(yīng)不會發(fā)生,因而自由dC及i－Motif結(jié)構(gòu)中C＋·反應(yīng)機(jī)理不一樣。