易通過(guò)冷凍食品傳播的新冠病毒解旋酶的表達(dá)純化及酶活研究

李海紅，鄭亞婷，高 博，韓曉睿，何怡寧， 侯錫苗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，陜西 楊凌 712100）

2019年12月下旬爆發(fā)的新型冠狀病毒（SARSCoV-2）導(dǎo)致了冠狀病毒疾病COVID-19，SARSCoV-2被世界衛(wèi)生組織報(bào)道成為全球范圍內(nèi)的大爆發(fā)，它的持續(xù)爆發(fā)已經(jīng)給世界各地的人類生命和經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。隨著近期全國(guó)多地的海關(guān)部門在冷凍食品中發(fā)現(xiàn)新冠病毒，此前武漢、北京、大連等多地的農(nóng)貿(mào)及海鮮市場(chǎng)都曾檢測(cè)到新冠病毒，這表明新冠病毒對(duì)人類食品安全產(chǎn)生重大的威脅。

冠狀病毒屬（Coronavirus）在系統(tǒng)分類上屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）[1]。冠狀病毒屬的基因組為線性單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)26-31kb，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒[2]，其基因組編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白，命名為Nsp1-Nsp16[3]，其中RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）、RNA解旋酶（Nsp13）及復(fù)制輔助因子（Nsp7、Nsp8）組裝成高效的RNA合成機(jī)器，該RNA復(fù)制體是病毒存活的核心部件，對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要[4]。

由于Nsp13在所有冠狀病毒物種中的高度保守性，被作為理想的抗病毒靶點(diǎn)[5-7]。有研究表明，SARS-CoV的Nsp13，具有NTP水解活性[8]，可以水解所有類型的NTP，以NTP依賴的方式解開雙鏈DNA和RNA，解旋的極性是5'-3'[9]。盡管是RNA解旋酶，但是Nsp13大約以相同的速率解旋RNA和DNA底物[10]。與其他解旋酶相比，Nsp13解旋酶的解旋效率較低，但可能通過(guò)不同的機(jī)制增強(qiáng)，如通過(guò)協(xié)同作用或者與病毒的RdRp相互作用[11-12]，除解旋酶活性外，Nsp13被認(rèn)為還具有RNA-5'-三磷酸酶活性，該活性可能在mRNA加帽中發(fā)揮作用。有研究表明，SARS-CoV-2的Nsp13解旋酶具有解旋DNA、RNA雙鏈的作用[9]。

研究表達(dá)并純化了高純度的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白，對(duì)其與RNA和DNA底物的結(jié)合及解旋雙鏈DNA的能力進(jìn)行了探究，研究結(jié)果可為理解SARSCoV-2的復(fù)制機(jī)理提供參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

質(zhì)粒與菌株pET21a-HMT表達(dá)載體和大腸桿菌菌株2984、BL21（DE3），均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑及儀器

Buffer A：25 mmol/L Tris-HCl溶液pH值8.0，500 mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑；新冠病毒（SARSCoV-2）Nsp13蛋 白 編 碼 序 列（SARS-CoV-2-Nsp13），Bio Matik公司提供；限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI，Takara公司提供；Ni-NTA Resin，QIAGEN公司提供；Heparin柱，GE Healthcare公司提供。

高壓破碎儀，JNBIO公司產(chǎn)品；AKTA purifier型蛋白純化儀，GE Healthcare公司產(chǎn)品。

1.1.3 DNA底物

寡聚核酸鏈，生工生物工程（上海）股份有限公司提供。結(jié)合試驗(yàn)及解旋試驗(yàn)的底物標(biāo)記有熒光素（Fluorescein，F(xiàn)）。底物的退火方式為寡聚核酸鏈按照摩爾比為1∶1的比例混合，95℃下加熱5 min，然后緩慢降至室溫。

結(jié)合及解旋試驗(yàn)中所用的DNA底物見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建及蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化

產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后，連入pET-21a-HMT載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤后，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）表達(dá)菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。37℃下培養(yǎng)至菌液吸光度A600約為0.6 h，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG（Merck），18℃下誘導(dǎo)16 h，收集菌體。用緩沖液懸浮菌體，并用高壓細(xì)胞破碎儀破碎菌體。高速離心收集上清后，先利用Amylose親和層析柱進(jìn)行初步純化，使用Elute Buffer（25 mmol/L Tris-HCl pH值8.0，200 mmol/L NaCl，5% Glycerol，0.5% Maltose）洗脫后，蛋白洗脫液稀釋降鹽后再利用Heparin Sepharose Fast Flow親和層析柱進(jìn)一步純化。純化產(chǎn)物通過(guò)10% SDS-PAGE檢測(cè)純度，合并較純組分并使用30 kD的Millipore超濾管離心濃縮，分裝后立即用液氮速凍，保存于-80℃下備用。

1.2.2 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的DNA、RNA結(jié)合活性測(cè)定

利用熒光偏振原理，測(cè)定SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶與單熒光標(biāo)記底物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)時(shí)的熒光各向異性的變化。反應(yīng)體系150μL，其中熒光標(biāo)記的DNA濃度為5 nmol/L，SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的濃度依次增加，緩沖液成分為25 mmol/L Tris pH值8.0，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，置于96孔黑色微孔板中，37℃孵育5 min后，使反應(yīng)體系達(dá)到平衡狀態(tài)，之后利用Infinite F200Pro型多功能酶標(biāo)儀（TECAN）測(cè)定每一個(gè)反應(yīng)體系的熒光各向異性值。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。用公式（1）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算平衡解離常數(shù)。

式中：Δrmax——測(cè)得的最高各向異性值（Δrmax=rmax,complex-rfree,DNA）；

Δr——測(cè)得的熒光各向異性值；

Kd——平衡解離常數(shù)；

P——蛋白質(zhì)的濃度，mmol/L；

n——希爾系數(shù)。

1.2.3 利用Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA）方法測(cè)定SARS-CoV-2-Nsp13解旋dsDNA

將3 nmol SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶和40 pmol熒光標(biāo)記的退火后雙鏈DNA底物5'OhS14D12加入到25 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），50 mmol/L Na-Cl，10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT中，反應(yīng)體系10μL，37℃孵育30 min，反應(yīng)被5×loading buffer終止（100 mmol/L Tris-HCl，1% SDS，50% Glycerol，and Bromophenol blue（pH值7.5）），待反應(yīng)結(jié)束后，以上混合物進(jìn)行10% Native-PAGE電泳后，并使用ChemiDoc MP拍照分析試驗(yàn)結(jié)果（BIO-RAD，USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SARS-CoV-2-Nsp13表達(dá)載體的構(gòu)建

重組pET21a-HMT-Nsp13的質(zhì)粒圖譜及EcoRI、XhoI雙酶切檢測(cè)見(jiàn)圖1。

圖1 重組pET21a-HMT-Nsp13的質(zhì)粒圖譜及EcoRI、XhoI雙酶切檢測(cè)

基因片段的前端依次連接有6×His標(biāo)簽和Maltose-binding protein（MBP）促溶標(biāo)簽。重組載體經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切后出現(xiàn)了目的蛋白片段（約1.9 kb）（見(jiàn)圖1（b）），并通過(guò)測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤。

2.2 重組SARS-CoV-2-Nsp13的表達(dá)與純化

將鑒定正確的重組載體轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中，18℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h，目的蛋白在破菌后的上清中有比較明顯的表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA親和層析純化可獲得大量目的蛋白。

SARS-CoV-2-Nsp13蛋白的表達(dá)純化見(jiàn)圖2。

（圖2（a）泳道5-7）；再利用Heparin柱梯度洗脫得到較純的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白（圖2（b）泳道1-7）；最終濃縮得到SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶（圖2（c）），大小約107 kD，與理論值相符。

圖2 SARS-CoV-2-Nsp13蛋白的表達(dá)純化

2.3 SARS-CoV-2-Nsp13的結(jié)合活力測(cè)定

利用熒光偏振原理，檢測(cè)SARS-CoV-2-Nsp13與單熒光標(biāo)記底物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)時(shí)的熒光各向異性的變化。不同濃度的SARS-CoV-2-Nsp13依次加入到150μL包含有5 nmol/L底物的緩沖液中，緩沖液成分為25 mmol/L Tris-HCl pH值7.5，20 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT。結(jié)果表明，隨著SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶濃度的增加，其結(jié)合ssDNA-18nt、5'OhS12D20、5'RNA HP-12nt12bp底物的各向異性呈S型曲線上升趨勢(shì)（圖3（a）），SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶結(jié)合單鏈DNA、帶有5'尾鏈的雙鏈DNA及RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的活力具有差異性，通過(guò)希爾方程擬合，得到SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶結(jié)合ssDNA-18nt、5'OhS12D20、5'RNA HP-12nt12bp的Kd值依次是0.720 99±0.036，0.366 9±0.018，0.393 36±0.02μmol/L，由Kd值可知，解旋酶與不同底物的結(jié)合活性強(qiáng)弱依次為5'OhS12D20＞5'RNA HP-12nt12bp＞ssDNA-18nt（圖3（b））。

SARS-CoV-2-Nsp13與不同底物的結(jié)合活性見(jiàn)圖3。

2.4 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶解旋活性的研究

由圖3（a）可知，在試驗(yàn)條件下，當(dāng)SARSCoV-2-Nsp13蛋白濃度在0.5~2.0μmol/L變化時(shí)，只能解開一部分雙鏈DNA，當(dāng)SARS-CoV-2-Nsp13蛋白濃度達(dá)到3μmol/L時(shí)，其解旋完全，解旋活性隨著蛋白濃度的升高而增強(qiáng)，因此確定SARSCoV-2-Nsp13解旋酶濃度為3μmol/L時(shí)可以完全解開DNA雙鏈。由圖3（b）可知，在試驗(yàn)條件下，反應(yīng)buffer中NaCl的濃度為80 mmol/L時(shí)，SARSCoV-2-Nsp13蛋白解旋DNA雙鏈的活力受到較為明顯的抑制，NaCl濃度30 mmol/L和50 mmol/L時(shí)，解旋活力相當(dāng)，考慮到底物的穩(wěn)定性，將解旋的NaCl濃度確定為50 mmol/L。

圖3 SARS-CoV-2-Nsp13與不同底物的結(jié)合活性

利用凝膠阻滯試驗(yàn)對(duì)SARS-CoV-2-Nsp13蛋白解旋雙鏈DNA的活性研究見(jiàn)圖4。

圖4 利用凝膠阻滯試驗(yàn)對(duì)SARS-CoV-2-Nsp13蛋白解旋雙鏈DNA的活性研究

3 結(jié)論

研究了新冠病毒Nsp13解旋酶的體外生化活性，結(jié)果表明，該解旋酶具有與單鏈DNA、帶有5'尾鏈的雙鏈DNA及RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合的活性；具有解旋帶有5'尾鏈的雙鏈DNA的活力，解旋的方向是5'-3'，且解旋活力受到NaCl的抑制。

新型冠狀病毒疫情已成為人類健康和生命的重大威脅。冠狀病毒編碼的RNA解旋酶是病毒復(fù)制復(fù)合體的重要組成部分，在病毒的傳播和感染中起到不可或缺的作用。因此，冠狀病毒編碼的RNA解旋酶被認(rèn)為是理想的抗病毒靶點(diǎn)。研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)純化了新冠病毒的解旋酶Nsp13。試驗(yàn)測(cè)定了SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶與不同DNA及RNA底物的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合帶有5'尾鏈的雙鏈DNA及RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的活力要強(qiáng)于單鏈DNA，這表明SARS-CoV-2-Nsp13在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮重要作用。通過(guò)希爾方程擬合，擬合曲線是S型，3個(gè)底物的n值均大于1，結(jié)果表明底物與SARSCoV-2-Nsp13的結(jié)合存在協(xié)同作用，這與先前文獻(xiàn)中研究一致[10]。SARS-CoV-2-Nsp13對(duì)于5'端存在尾鏈的雙鏈DNA和RNA發(fā)卡高的親和力是其能夠解旋雙鏈DNA和RNA的保證。EMSA試驗(yàn)表明，SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有解旋DNA雙鏈的活力，解旋的方向是從5'-3'，解旋的最適蛋白濃度為3μmol/L，解旋反應(yīng)中高的NaCl濃度會(huì)抑制SARSCoV-2-Nsp13解旋雙鏈DNA的活力。

試驗(yàn)結(jié)果表明，SARS-CoV-2-Nsp13解旋DNA雙鏈沿著5'-3'方向進(jìn)行，而且需要DNA雙鏈的5'端帶有尾鏈，這與之前報(bào)道的SARS-CoV-Nsp13一致。不同的是Jia Z等人[11]報(bào)道SARS-CoV-Nsp13解旋酶可以解旋15 bp長(zhǎng)度雙鏈DNA，比試驗(yàn)結(jié)果稍長(zhǎng)一些，可能的原因是試驗(yàn)中所使用的底物序列不同，另外Jia Z等人[11]的解旋反應(yīng)體系中加入了DNA trap，這可能在一定程度上有利于解旋。

研究進(jìn)一步拓展了對(duì)新型冠狀病毒復(fù)制體的理解，對(duì)新型冠狀病毒解旋酶Nsp13可作為抗病毒藥物研發(fā)中一個(gè)有價(jià)值的靶點(diǎn)提供了試驗(yàn)支持，從而有助于新冠疫情的防控和醫(yī)治。