基于“熵增驅(qū)動(dòng)凝膠形成”理論的魔芋葡甘聚糖
——表沒食子兒茶素沒食子酸酯拓?fù)湮⒛z的制備及其抗氧化性研究

王雅立， 龐 杰，顏吉強(qiáng)

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息學(xué)院，福建 福州 350002）

茶多酚是一種植物多酚，是綠茶中有效的天然抗氧化劑，作為一種抗氧化劑和品質(zhì)保持劑（防腐劑）[1]，其價(jià)值已經(jīng)被世界所公認(rèn)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中清除自由基、抗氧化能力最強(qiáng)的一種，但有研究表明，其在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、光照和高熱條件下不穩(wěn)定，而且在體內(nèi)生物利用度也較低[1-2]，這些因素都限制了EGCG的推廣應(yīng)用[3]。目前，以多糖微凝膠為載體的高分子-功能因子的軛合物體系在改善EGCG親水性、提高靶向性，以及增加生物利用度[3-5]方面都具有比較顯著的優(yōu)越性。但真正進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用的此類軛合物還是比較少，這是因?yàn)槎嗵悄z體系形成缺乏有效控制，因而影響其力學(xué)性質(zhì)。由于凝膠形成過程總是伴隨著系統(tǒng)熵的變化[6-7]。因此，通過一定條件下調(diào)控系統(tǒng)熵的變化，可以有效促進(jìn)凝膠的形成，優(yōu)化凝膠的力學(xué)性質(zhì)。

魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomman，KGM）是由葡萄糖和甘露糖以β-1,4糖苷鍵連接起來的高分子雜多糖，具有良好的生物兼容性和可降解性[8]。在一定條件下，KGM可形成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，有利于提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性[9-10]。因此，嘗試運(yùn)用試驗(yàn)分析手段、計(jì)算機(jī)模擬和拓?fù)鋵W(xué)分析相結(jié)合的方法，基于“熵增驅(qū)動(dòng)凝膠形成”理論，以KGM為對象，促進(jìn)KGM拓?fù)湮⒛z的形成，制備功能化拓?fù)湫蚄GM微凝膠并驗(yàn)證其抗氧化性。以期為基于拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的KGM功能凝膠的研究提供理論依據(jù)，也為綠茶的深加工和實(shí)用價(jià)值的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉（KGM純度95%），廣西多環(huán)公司提供；纖維素酶，無錫酶試劑廠提供；表沒食子茶多酚沒食子酸酯（EGCG），成都生物制藥有限公司提供；DPPH，日本東京工業(yè)公司提供；KH2PO4、K2HPO4，國藥控股化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 KGM-EGCG微凝膠的制備

1.2.1 低分子量KGM的制備

精密稱取KGM（3 g），置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，使KGM在水中充分溶脹形成凝膠。以180 U/g的纖維素酶，在酶解后，在pH值6，溫度50℃下，酶解30 min，用80%乙醇做沉淀劑，不停攪拌，逐漸有白色絮狀沉淀產(chǎn)生，繼續(xù)加入乙醇溶液直至不再產(chǎn)生沉淀為止，用玻璃棒小心將白色沉淀轉(zhuǎn)移到燒杯中，用95%的乙醇洗滌2次，最后將此產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到表面皿中，真空冷凍干燥得樣品。隨后超微粉碎過200目篩獲得KGM低聚物顆粒。

1.2.2 EGCG溶液的制備

稱取一定量的EGCG（0.2 g），溶解在100 mL水溶液中，在50℃條件下，充分混合即得EGCG溶液。

1.2.3 KGM-EGCG微凝膠的制備

稱取一定量的EGCG，溶解在100 mL一定濃度的低分子量KGM溶液中，在適宜溫度條件下，兩者混合后繼續(xù)以轉(zhuǎn)速600 r/min攪拌60 min，使KGM和EGCG兩者充分溶脹，得到微凝膠。使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，12 h之后取出。過200目篩，得到微凝膠。

綜合考查試驗(yàn)條件，共設(shè)計(jì)了3個(gè)單因素試驗(yàn)，對EGCG/KGM微凝膠的制備進(jìn)行考查，3個(gè)單因素分別為KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、EGCG/KGM質(zhì)量比（B）和溫度（C），以微凝膠的包埋率為指標(biāo)，得出每種因素對微凝膠包埋率的影響。包埋率的公式（1）[11]為：

采用溶劑對微凝膠表面進(jìn)行清洗，并測量微凝膠外未包裹的EGCG。EGCG含量測量參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2018[12]，通過HPLC法進(jìn)行測定。

（1）KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇。固定EGCG/KGM的質(zhì)量比為1∶10，反應(yīng)溫度為50℃，制備一定體積的KGM溶液，按照KGM溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%來稱取KGM，并制備微凝膠，遴選最佳KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

（2）EGCG/KGM質(zhì)量比的選擇。固定KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，反應(yīng)溫度為50℃，按照EGCG與KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20來制備微凝膠，篩選出最佳的EGCG/KGM質(zhì)量比。

（3）反應(yīng)溫度的選擇。固體微凝膠的KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，EGCG/KGM質(zhì)量比為1∶10，設(shè)定KGM溶液與壁材膠體混合時(shí)的反應(yīng)溫度為40，45，50，55，60℃，并制備微凝膠，篩選出最佳反應(yīng)溫度。

1.3 KGM-EGCG微凝膠的表征

1.3.1 掃描電子顯微鏡

在掃描電子顯微鏡下觀察KGM粉末、KGMEGCG微凝膠的表面形貌，最大加速電壓為15 kV。

1.3.2 紅外光譜掃描

充分碾碎KGM和KGM-EGCG并采用KBr粉末壓片，紅外光譜測定波長為4 000~400 nm，儀器分辨率0.5 nm，掃描次數(shù)為32/64。

1.4 KGM-EGCG微凝膠抗氧化性能力的測定

1.4.1 O2-·清除率的測定

O2-·清除率的測定參照參考文獻(xiàn)[13-15]的方法并作修改。將鄰苯三酚溶于10 mmol/L HCl中配制濃度為3 mmol/L的溶液。取pH值8.2的Tris-HCl緩沖液（濃度100 mmol/L）4.5 mL于25℃水浴保溫20 min，再加入鄰苯三酚1 mL（試驗(yàn)前于25℃保溫），迅速搖勻并開始計(jì)時(shí)，每隔30 s于波長325 nm處測定吸光度A325，反應(yīng)4.5 min后結(jié)束。計(jì)算公式（2）為：

式中：v空——KGM-EGCG微凝膠抑制鄰苯三酚自氧化的速率；

v樣——空白管中以蒸餾水作對照抑制鄰苯三酚自氧化的速率。

1.4.2 DPPH·清除率的測定

參照參考文獻(xiàn)[16-18]的方法，用95%乙醇溶液配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL DPPH溶液于試管中，在暗室下避光反應(yīng)30 min后于波長517 nm處測定吸光度（As）。以95%乙醇溶液作為對照（Ac），空白對照以95%乙醇溶液代替DPPH溶液（Ab）。DPPH清除率按公式（3）計(jì)算：

1.5 計(jì)算機(jī)模擬方法

應(yīng)用AutoDock Vina軟件對EGCG和PPO中的酪氨酸酶分子進(jìn)行對接[4]。建立EGCG和酪氨酸酶分子坐標(biāo)文件，確定EGCG和酪氨酸酶發(fā)生相互作用的格子參數(shù)條件。將準(zhǔn)備好的EGCG和酪氨酸酶分子坐標(biāo)文件和格子參數(shù)文件輸入對接程序，運(yùn)行后給出配體分子對接的構(gòu)象，分析預(yù)測能量。對配體分子進(jìn)行相似構(gòu)象聚類分析和配體分子構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。

1.6 理論方法

根據(jù)玻爾茲曼的理論，一個(gè)系統(tǒng)的自由能與所有可能的能量有關(guān)。對于一種給定狀態(tài)的能量，其依賴于每個(gè)分子鏈與它周圍物質(zhì)之間的交互作用[18]。KGM拓?fù)湮⒛z的形成是一個(gè)拓?fù)浞肿渔溨匦缕胶獾倪^程，過程中伴隨著能量變化和熵增。因此，依據(jù)熱力學(xué)理論，可以通過減少溶劑熵，增加溶質(zhì)熵來促進(jìn)“熵增驅(qū)動(dòng)下的凝膠形成”。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG與酪氨酸酶相互作用的計(jì)算機(jī)模擬分析

多酚氧化酶（PPO）廣泛存在于自然界中，在動(dòng)植物組織中均可檢測到。在廣義上，多酚氧化酶可分為三類，廣泛分布于植物和微生物中，微生物中包括酪氨酸酶和漆酶。研究表明，EGCG對于酪氨酸酶有抑制作用，且抑制率會(huì)隨著濃度增大而提升[19]。為了分析EGCG與酪氨酸酶的相互作用，通過AutoDock Vina軟件對EGCG與酪氨酸酶的相互作用的分子對接進(jìn)行分析。

2.1.1 疏水作用下的EGCG與酪氨酸酶分子對接

疏水作用下的EGCG與酪氨酸酶分子對接見圖1。

圖1 疏水作用下的EGCG與酪氨酸酶分子對接

圖1中的虛線為疏水鍵，根據(jù)模擬結(jié)果，酪氨酸酶分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在水中會(huì)以疏水軸為中心形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊，折疊過程中，酪氨酸酶傾向于將疏水基團(tuán)埋藏在分子內(nèi)部，將親水基團(tuán)暴露在外部的現(xiàn)象。此時(shí)，系統(tǒng)呈現(xiàn)熵值增加的情況，由于分子鏈運(yùn)動(dòng)活躍，疏水作用進(jìn)一步增強(qiáng)，使酪氨酸分子產(chǎn)生自我聚集現(xiàn)象，形成分子內(nèi)部空間。而反應(yīng)中EGCG通過疏水鍵向酪氨酸酶分子表面靠近，并通過疏水作用進(jìn)入到酪氨酸的疏水空間中與酪氨酸酶分子鏈產(chǎn)生相互作用，體系整體熵值增加，并且熵增成為疏水作用的驅(qū)動(dòng)力，促進(jìn)EGCG與酪氨酸酶進(jìn)一步結(jié)合，這結(jié)果符合“手套2手”的反應(yīng)模式[20]。

2.1.2 EGCG與酪氨酸酶的分子結(jié)合

EGCG/酪氨酸酶分子結(jié)合的氫鍵見圖2。

圖2 EGCG/酪氨酸酶分子結(jié)合的氫鍵

圖2中的虛線為氫鍵，根據(jù)模擬結(jié)果，當(dāng)EGCG進(jìn)入酪氨酸酶的疏水內(nèi)空間后，兩者之間通過多點(diǎn)氫鍵結(jié)合，形成緊密接觸，形成一定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而減小酪氨酸酶的水力學(xué)半徑，使其產(chǎn)生一定的構(gòu)象變化。氫鍵的形成有利于整體系統(tǒng)的穩(wěn)定，降低系統(tǒng)能量。據(jù)此可得，隨著EGCG濃度增大，其對疏水作用的貢獻(xiàn)會(huì)增大，氫鍵連接數(shù)量會(huì)增多。兩者的結(jié)合過程中，分子間作用力增強(qiáng)，存在明顯的焓熵補(bǔ)償現(xiàn)象。

2.1.3 EGCG與酪氨酸酶結(jié)合的穩(wěn)定性

EGCG與酪氨酸酶兩者結(jié)合會(huì)帶來體系構(gòu)象的變化?？梢酝ㄟ^運(yùn)動(dòng)學(xué)描述來考查結(jié)合前后2個(gè)狀態(tài)坐標(biāo)的差異來評價(jià)分子結(jié)構(gòu)變化的程度[4]。假定體系中所選粒子組有n個(gè)粒子，計(jì)算狀態(tài)的體系坐標(biāo)為vi，參考狀態(tài)的體系坐標(biāo)為wi，則粒子（組）的參考位置的偏差平均大?。≧MSD）為：

EGCG/酪氨酸酶分子對接的能量見表1。

RMSD描述粒子（組）與參考位置的偏差平均大小，RMSD越小說明分子構(gòu)象變化越小，體系越穩(wěn)定[4]。由表1可知，通過多次模擬，在EGCG/酪氨酸酶最佳分子對接下，分子間作用力變化幅度較少，但系統(tǒng)的RMSD均較大。說明了熵增體系中，兩者結(jié)合分子鏈的動(dòng)態(tài)變化多，粒子位移大，構(gòu)象變化大，兩者對接體系不穩(wěn)定。

表1 EGCG/酪氨酸酶分子對接的能量

2.1.4 最佳對接情況三級(jí)結(jié)構(gòu)下的穩(wěn)定性

最佳對接情況三級(jí)結(jié)構(gòu)下的溫度因子圖見圖3。

圖3 最佳對接情況三級(jí)結(jié)構(gòu)下的溫度因子圖

由圖3可知，藍(lán)色結(jié)構(gòu)是柔性較小、比較穩(wěn)定的部分，而紅色部分則是柔性較大，在模擬過程中不太穩(wěn)定的部分。以此作為評價(jià)EGCG-酪氨酸酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性或選取功能設(shè)計(jì)部分的依據(jù)，可知分子對接中EGCG分子鏈不穩(wěn)定性較高。EGCG分子鏈的斷裂會(huì)造成對接網(wǎng)絡(luò)體系構(gòu)象和力學(xué)半徑的變化，因此保證EGCG構(gòu)象的穩(wěn)定性是調(diào)控對接體系穩(wěn)定性的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.2 溶質(zhì)熵增下的KGM拓?fù)湮⒛z的形成

根據(jù)玻爾茲曼的理論，一個(gè)系統(tǒng)的自由能與所有可能的能量有關(guān)。對于一種給定狀態(tài)的能量，其依賴于每個(gè)分子鏈與它周圍物質(zhì)之間的交互作用[18]。應(yīng)用熵的多粒子相關(guān)函數(shù)理論可以把溶液的熵及內(nèi)能分成3個(gè)部分：①溶劑-溶劑相互作用“ss”；②溶質(zhì)-溶劑相互作用“sp”；③溶質(zhì)-溶質(zhì)“pp”相互作用[18]。

整體能量可以表述為：

式中：z——給定格子空間內(nèi)的配位數(shù)；

M——空間內(nèi)的高分子鏈的數(shù)目；

φ——溶劑的體積分?jǐn)?shù)。

當(dāng)考慮高分子鏈為單個(gè)分子鏈時(shí)，可以得到相應(yīng)的熵為：

當(dāng)考慮高分子鏈而不是單個(gè)分子鏈時(shí)，高分子分子鏈數(shù)量為N時(shí)，可以得到相應(yīng)的熵項(xiàng)為：

KGM凝膠的形成是其拓?fù)浞肿渔溄Y(jié)構(gòu)重新平衡的過程，是個(gè)溶質(zhì)-溶質(zhì)相互作用起主導(dǎo)作用的能量變化的過程[21]，是一個(gè)包含熵增的過程；溶質(zhì)-溶劑熵的存在有利于系統(tǒng)平衡；溶劑熵增大會(huì)提高凝膠的溶解度。結(jié)合以上數(shù)學(xué)公式，在環(huán)境條件不變的情況下，要促進(jìn)KGM拓?fù)淠z的形成，需要降低體系的溶劑熵并對分子鏈的長度進(jìn)行調(diào)整。由公式（4）可知，在溫度、壓力等環(huán)境條件不變的情況下，KGM拓?fù)浞肿渔溨挥蝎@得足夠的自由能和熵才能形成穩(wěn)定的分子間纏結(jié)，從而達(dá)到新的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，因此需要減少溶劑熵[22]。KGM分子量大，分子鏈長，會(huì)減少構(gòu)型，它們的熵減少為1/N。當(dāng)高分子鏈非常長的時(shí)候，熵只包含溶劑的貢獻(xiàn)。因此，需要通過適當(dāng)調(diào)控KGM分子鏈的長度。在試驗(yàn)對KGM高分子進(jìn)行水解，以提高溶質(zhì)熵，并促進(jìn)拓?fù)湮⒛z的形成。

2.3 KGM-EGCG微凝膠制備

2.3.1 EGCG含量的篩選

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2018[23]，制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)色譜條件檢測，進(jìn)樣量為10.0μL，樣品進(jìn)樣2次，測定EGCG含量。

EGCG色譜圖見圖4。

圖4 EGCG色譜圖

2.3.2 KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的篩選

固定EGCG/KGM質(zhì)量比及反應(yīng)溫度，用5種KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)制備出微凝膠的包埋率。

KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響見圖5。

圖5 KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響

由圖5可知，微凝膠的包埋率隨著KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而上升，但當(dāng)?shù)头肿恿縆GM質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)2%之后包埋率上升趨于平緩。可能的原因是在質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%之后，分子鏈的空間位阻增多，阻礙了EGCG進(jìn)入KGM拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致EGCG的包埋量并沒有隨著KGM的增加繼續(xù)增加，與增加量不呈正比。在KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%之后，溶液濃度太大，已無法攪拌，故選擇KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

2.3.3 EGCG/KGM的質(zhì)量比篩選

固定KGM濃度和反應(yīng)溫度，用5種不同EGCG/KGM質(zhì)量比制備微凝膠的包埋率。

EGCG/KGM質(zhì)量比對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響見圖6。

圖6 EGCG/KGM質(zhì)量比對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響

由圖6可知，微凝膠的包埋率先上升后下降，最高峰出現(xiàn)在EGCG/KGM質(zhì)量比為1∶10處，所以質(zhì)量比選擇為1∶10。結(jié)果分析，KGM濃度增大，分子鏈間作用力增大，分子鏈纏結(jié)增多，增大了空間位阻，從而阻礙了EGCG分子進(jìn)入KGM拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。

2.3.4 最適反應(yīng)溫度的篩選

固定KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)和EGCG/KGM質(zhì)量比之后，在5個(gè)反應(yīng)溫度下制備微凝膠的包埋率。

溫度對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響見圖7。

由圖7可知，微凝膠的包埋率隨著溫度的增加而增加，在50℃之后升高的速度減慢。因?yàn)殡S著溫度升高體系能量增加，出現(xiàn)熵增情況，KGM拓?fù)浞肿渔溸\(yùn)動(dòng)加劇，分子鏈之間形成有序的空間拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以較好地包埋并保護(hù)EGCG分子，但是溫度過高會(huì)造成EGCG分子的不穩(wěn)定和分解，從而降低了包埋率，所以選用50℃為反應(yīng)溫度。

圖7 溫度對KGM-EGCG微凝膠包埋率的影響

2.4 KGM-EGCG微凝膠的表征

2.4.1 掃描電子顯微鏡譜圖分析

KGM粉末（a）和KGM-EGCG微凝膠（b）掃描電鏡圖見圖8。

圖8 KGM粉末（a）和KGM-EGCG微凝膠（b）掃描電鏡圖

由圖8（a）可知，圖KGM在粉末狀態(tài)下，外表呈現(xiàn)規(guī)則的微纖維狀，表明KGM分子量很大，長分子鏈以列向形態(tài)排列，長鏈之間以氫鍵相互作用，形成凝聚纏結(jié)為主的微觀構(gòu)。

由圖8（b）可知，降解后KGM長分子鏈仍然存在，由于分子量降低，部分長分子鏈被降解為小分子鏈，空間位阻減小，有利于KGM-EGCG分子鏈之間形成非共價(jià)相互作用。KGM表面的羥基與水形成剛性結(jié)構(gòu)，內(nèi)部形成疏水空腔或間隙，接著通過疏水相互作用驅(qū)使EGCG進(jìn)入空腔或間隙，并且形成分子鏈間氫鍵增強(qiáng)其結(jié)合效果，其結(jié)果導(dǎo)致微凝膠體系內(nèi)部形成不同的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)。調(diào)節(jié)控制下的KGM-EGCG的混合使得體系混合過程勻化，避免了局部過度纏結(jié)，避免分子鏈混亂纏結(jié)的發(fā)生，使得網(wǎng)絡(luò)體系形成有序的分子間拓?fù)淅p結(jié)網(wǎng)絡(luò)體系。

2.4.2 紅外光譜譜圖分析

KGM和KGM-EGCG微凝膠的紅外光譜圖見圖9。

由圖9可知，相較于KGM凝膠，KGM-EGCG微凝膠在波數(shù)3 435 cm-1處（-OH的吸收峰）的吸收峰減弱，表明KGM-EGCG微凝膠中有更多氫鍵的形成。同時(shí)，KGM-EGCG微凝膠在波數(shù)2 928 cm-1出現(xiàn)了一個(gè)明顯的吸收峰，這是甲基中C-H的吸收峰，證明了KGM-EGCG微凝膠中，KGM與EGCG分子鏈之間形成拓?fù)淅p結(jié)，與電鏡測定結(jié)果相一致。

圖9 KGM和KGM-EGCG微凝膠的紅外光譜圖

2.4.3 KGM-EGCG微凝膠抗氧化能力分析

（1）O2-·清除率分析。

不同濃度下EGCG與KGM-EGCG對于O2-·清除率對比測定見圖10。

圖10 不同濃度下EGCG與KGM-EGCG對于O2-·清除率對比測定

O2-·清除率是物質(zhì)抗氧化能力指標(biāo)之一，O2-·清除率越強(qiáng)表示物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖10可知，以KGM微凝膠為載體的EGCG對于O2-·清除率隨著質(zhì)量濃度增大而增大，與EGCG溶液表現(xiàn)出等同的清除能力。

（2）DPPH·清除率分析。

不同質(zhì)量濃度下EGCG與KGM-EGCG對于DPPH·清除率對比測定見圖11。

DPPH·清除率也是物質(zhì)抗氧化活性能力的表征之一，DPPH·清除能力越大，表明物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)。由圖11可知，EGCG和KGM-EGCG兩者都隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)DPPH·清除率。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，KGM-EGCG微凝膠的DPPH清除率達(dá)到了93%。

圖11 不同質(zhì)量濃度下EGCG與KGM-EGCG對于DPPH·清除率對比測定

3 結(jié)論

微凝膠和相應(yīng)的宏觀凝膠具有相同的化學(xué)組成和熱力學(xué)性質(zhì)，但是微凝膠對環(huán)境引發(fā)的溶脹和分子結(jié)合的變化反應(yīng)更加迅速，使其能夠在受控和限制的條件下得到更好的應(yīng)用[6，24]。而且微凝膠能夠?qū)⒒瘜W(xué)官能團(tuán)對于高分子整體結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性、滲透性和變形性結(jié)合起來，以獨(dú)特的方式將膠體聚合物和表面活性劑結(jié)合起來[25-26]。

在大多數(shù)情況下，凝膠網(wǎng)絡(luò)中的連接是局部化的，是短距離相互作用的結(jié)果，但是在短距離的連接的基礎(chǔ)上，長鏈會(huì)連接并形成宏觀的網(wǎng)絡(luò)。因此，大多數(shù)凝膠的分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成是通過分子鏈在有限空間內(nèi)的擴(kuò)展連接局部連接來實(shí)現(xiàn)的。KGM作為高分子長鏈物質(zhì)，在可逆凝膠形成以下2種途徑：①通過自身連接組裝形成長鏈來組裝形成宏觀的網(wǎng)絡(luò)，如KGM單體凝膠；②通過與其他物質(zhì)的分子鏈互相穿插交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，如KGM與卡拉膠、黃原膠、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的復(fù)配，在協(xié)同作用下形成機(jī)械強(qiáng)度較好的凝膠。研究表明，復(fù)配凝膠的特點(diǎn)是分子間的疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作用力增強(qiáng)，復(fù)配膠體的膠束緊密纏繞鏈接。

通過分子模擬研究了EGCG和酪氨酸酶的分子結(jié)合，明確了兩者結(jié)合是在熵焓補(bǔ)償現(xiàn)象下，通過疏水作用進(jìn)行分子鏈間的相互作用，并通過氫鍵增強(qiáng)結(jié)合效果，但是EGCG在與酪氨酸酶結(jié)合過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，需要加以調(diào)控。以微凝膠為載體，實(shí)現(xiàn)EGCG的有效承載和釋放是一個(gè)有效的調(diào)控途徑。研究中根據(jù)熵增驅(qū)動(dòng)拓?fù)銴GM凝膠形成理論，通過酶降解KGM，降低分子量，降解部分長分子鏈為短鏈，減少網(wǎng)絡(luò)體系的空間位阻，增加分子鏈內(nèi)部纏結(jié)的空間，并形成有效的拓?fù)淅p結(jié)，來調(diào)控KGM有序拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而促進(jìn)KGM-EGCG微凝膠的形成。

KGM-EGCG微凝膠制備過程中，沒有使用改性劑和催化劑，沒有引入毒性基團(tuán)，不會(huì)對樣品造成二次污染，通過合理調(diào)控，使之產(chǎn)生有序的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并保留了KGM的生物活性，從而產(chǎn)生較好的控釋效果。試驗(yàn)結(jié)果為KGM功能凝膠用于對活性成分的保護(hù)的研究提供理論依據(jù)和有益補(bǔ)充，也為綠茶的深加工和實(shí)用價(jià)值的提升提供參考。