腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體miRNA-656-3p調(diào)控喉癌生長侵襲及丹參酮ⅡA對其調(diào)控研究△

王媚 吳春萍 郭裕 王麗華 胡蓉 張珺珺 王慈 丁毅

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200071；2.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200031)

外泌體是腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞相互作用的重要媒介，是近年來腫瘤微環(huán)境研究的前沿和熱點。外泌體是直徑為30～150 nm的微囊泡結(jié)構(gòu)，包裹著蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA等生物活性分子，是腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間信息傳遞的重要載體[1-3]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)外泌體miRNAs的異常表達(dá)是新發(fā)現(xiàn)的影響腫瘤起始、生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要機制，是腫瘤微環(huán)境失衡的重要特征和腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。目前已在肝癌[4]和乳腺癌[5]等腫瘤中發(fā)現(xiàn)了此類調(diào)控作用，但具體異常表達(dá)的miRNAs種類及下游調(diào)控機制因腫瘤而異。

喉癌組織中的CAFs能夠明顯促進(jìn)喉癌細(xì)胞的體外增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)致瘤能力，并明顯抑制原代喉癌細(xì)胞的體外凋亡[6-8]。我們推測，喉癌腫瘤微環(huán)境中可能同樣存在CAFs外泌體miRNAs的異常表達(dá)。目前國內(nèi)外尚未見喉癌CAFs外泌體miRNAs異常表達(dá)關(guān)鍵miRNAs的研究報道。我們預(yù)實驗研究喉癌CAFs原代培養(yǎng)及外泌體miRNAs高通量測序檢測發(fā)現(xiàn)，CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)顯著下降。本研究的目的為驗證表達(dá)下調(diào)的外泌體miR-656-3p對喉癌細(xì)胞增殖、侵襲和周期的影響，并探索可能的機制。此外，我們檢測了中藥提取物丹參酮ⅡA是否具有類似的上調(diào)CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)，并通過后者抑制喉癌細(xì)胞增殖和侵襲的功效。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 喉癌CAFs及AMC-HN-8細(xì)胞系來源于復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科課題組，2種細(xì)胞均培養(yǎng)于高糖DMEM(4 500 mg/L，Hyclone，美國)+1%青鏈雙抗(Gibco，美國)+10%去外泌體胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS，Gibco)。去外泌體FBS的制備可用常規(guī)FBS在120 000×g離心力下過夜離心，取上清后以0.45 μm的濾膜過濾。2種細(xì)胞均置入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 CAFs外泌體提取及鑒定

1.2.1 外泌體提取 采用超速離心法。收集CAFs培養(yǎng)液上清于50 mL離心管中離心(4 ℃，500×g)10 min；取上清再置于50 mL離心管中離心(4 ℃，2 000×g)20 min；再取上清置于50 mL離心管中離心(4 ℃，10 000×g)30 min；收集上清，用0.22 μm濾膜過濾后再次離心(4 ℃，120 000×g)70 min；棄上清，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)重懸沉淀后再次離心(4 ℃，120 000×g)70 min；棄上清得到外泌體沉淀，50 μL PBS重懸。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外泌體鑒定

1)透射電鏡觀察。取外泌體懸液用PBS 稀釋10倍后取20 μL稀釋懸液，滴加至碳覆膜銅網(wǎng)上，濾紙吸除多余液體。室溫干燥過夜后用1%戊二醛固定和醋酸雙氧鈾避光染色30 s，濾紙吸除多余液體。室溫風(fēng)干10 min后用透射電鏡在80 kV下觀察并拍照。

2)納米粒徑追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)。取外泌體懸液100 μL，4 ℃條件下PBS 稀釋10倍，加入比色皿。置入粒度電位儀樣品池中，布朗運動60 s后，用Nanosight 粒子追蹤軟件分析納米粒子濃度和大小分布。

3)Western印跡。外泌體沉淀及對照細(xì)胞用RIPA裂解液(碧云天，南通)裂解，蛋白濃度測定后上樣。SDS凝膠(碧云天)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜(Millipore，美國)。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗CD81(1∶1 000，Abcam，美國)、TSG101 (1∶2 000，Abcam) 及Calnexin (1∶2 000，Abcam)4 ℃過夜孵化，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗(1∶2 000；Jackson)室溫孵化1 h。最后BeyoECL Plus試劑盒(碧云天，南通)顯色拍照。

1.3 miR-656-3p過表達(dá) 采用分子克隆的常用方法，以pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen，美國)真核表達(dá)載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建miR-656-3p過表達(dá)質(zhì)粒。CAFs按2×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染(均按操作步驟進(jìn)行)，轉(zhuǎn)染無關(guān)干擾序列的CAFs為NC對照組，只添加轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000的CAFs為Mock對照組，而不添加任何試劑的CAFs為空白對照組。用實時PCR (real-time PCR，RT-PCR)驗證miR-656-3p過表達(dá)效果，所用miR-656-3p及內(nèi)參引物和PCR步驟見后文1.5。

1.4 丹參酮ⅡA儲存液及條件培養(yǎng)基的制備

1.4.1 丹參酮ⅡA儲存液配置 丹參酮ⅡA(Tan ⅡA)購自中國藥品生物制品檢定所，純度 98%，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制為10 mmol/L儲存液，0.22 μm濾膜過濾除菌4 ℃冷藏備用。本研究中丹參酮ⅡA的細(xì)胞培養(yǎng)時終濃度為10 μmol/L。

1.4.2 miR-656-3p過表達(dá)CAFs培養(yǎng)液上清外泌體母液的制備 將miR-656-3p過表達(dá)CAFs培養(yǎng)48 h接近匯合后收集培養(yǎng)液上清，按照上文1.2.1步驟提取外泌體，最終將5 mL CAFs培養(yǎng)液上清所得外泌體沉淀加100 μLPBS重懸，作為進(jìn)一步實驗的外泌體母液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。命名為conditioned medium miR-656-3p過表達(dá)(CM miR-656-3p過表達(dá))。

1.4.3 丹參酮ⅡA作用后的CAFs培養(yǎng)液上清外泌體母液的制備 在CAFs培養(yǎng)液中加入丹參酮ⅡA使其終濃度為10 μmol/L，培養(yǎng)48 h后同上法收集外泌體沉淀，加PBS重懸，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ麨閏onditioned medium 丹參酮ⅡA(CM Tan ⅡA)。

1.5 CAFs外泌體miR-656-3p不同表達(dá)水平的RTPCR驗證 收集不同處理方法后的5組CAFs培養(yǎng)液上清中的外泌體用RT-PCR檢測miR-656-3p表達(dá)水平。第①～③組：將過表達(dá)外泌體miR-656-3p的CAFs(實驗組、對照組及Mock組)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液上清收集后用上述超速離心法收集外泌體沉淀備用。第④組：在常規(guī)CAFs培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μmol/L的丹參酮ⅡA培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液上清，同法收集外泌體沉淀備用。第⑤組：將不做任何處理的CAFs培養(yǎng)48 h，同法收集培養(yǎng)液上清中的外泌體備用，作為空白對照組。

TRIzol法提取5組外泌體沉淀中的總RNA，用NanoDrop 2000C 紫外可見光光度計(Thermo Evolution，美國)檢測OD260/OD280值，評估RNA樣品的濃度及純度。用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara，大連)逆轉(zhuǎn)錄RNA，用SYBR? Premix Ex TaqTM (Takara，大連)進(jìn)行PCR擴增，均根據(jù)說明操作。snRNA U6作為內(nèi)參對照，2-ΔCT法計算目標(biāo)miRNA相對于snRNA U6的表達(dá)水平。熱循環(huán)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s，40個循環(huán)(95 ℃ 變性5 s及60 ℃退火延伸34 s)，溶解曲線(95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)。引物(生工生物，上海)序列見表1。

表1 miRNAs引物序列

1.6 增殖實驗 采用CCK8方法檢測。將相同數(shù)量的喉癌細(xì)胞(3 000個細(xì)胞/孔)懸浮于200 μL DMEM培養(yǎng)液(含10%無外泌體FBS及1%青鏈雙抗)，接種到96孔板中；實驗1組及2組分別加入10 μL以上2種不同的CAFs外泌體母液(CM miR-656-3p過表達(dá)及CM TanⅡA)。以不加外泌體母液培養(yǎng)于200 μL DMEM培養(yǎng)液(含10%無外泌體FBS及1%青鏈雙抗)的相同數(shù)量的喉癌細(xì)胞為對照。將3組細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，各孔加入20 μL的CCK-8，37 ℃孵化3 h，用酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm處的吸光度值。以培養(yǎng)時間和吸光度值均數(shù)作曲線，評估各組細(xì)胞的增殖能力差異。

1.7 侵襲實驗 采用Transwell檢測。將數(shù)量相同的喉癌細(xì)胞(2 000個細(xì)胞/孔)懸浮于200 μL無血清EMEM，接種到底面鋪好基質(zhì)膠的孔徑8 μm Transwell上室底部，下室加入約600 μL含血清(20%無外泌體FBS)DMEM。實驗1組及2組分別于上室加入10 μL以上2種不同的CAFs外泌體母液(CM miR-656-3p過表達(dá)及CM Tan ⅡA)，以不加外泌體母液組喉癌細(xì)胞為對照。Transwell小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出上室，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌，棉簽擦去上室底部上表面的細(xì)胞；將上室底部下表面的細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定15 min，再用0.25% 結(jié)晶紫染色10 min。用顯微鏡觀察上室底部下表面10個隨機視野計數(shù)，取均值。比較各組喉癌細(xì)胞的侵襲能力差異。

1.8 細(xì)胞周期 用流式細(xì)胞儀檢測。將喉癌細(xì)胞懸浮于2 mL DMEM培養(yǎng)液(含10%無外泌體FBS及1%青鏈雙抗)，接種于6孔培養(yǎng)板(5 000個細(xì)胞/孔)。實驗1組及2組分別加入1 mL以上2種不同的CAFs外泌體母液(CM miR-656-3p過表達(dá)及CM Tan ⅡA)，以不加外泌體母液組喉癌細(xì)胞為對照。培養(yǎng)48 h后消化收集喉癌細(xì)胞，PBS洗2遍。離心后加入70%的冰乙醇，4 ℃固定，過夜。PBS洗滌，加入RNA酶(20 μg/mL)，37 ℃孵化30 min。PBS洗滌，再加入碘化丙啶溶液(PI，15 μmol/L)孵化10 min。40μm濾網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團塊，流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 周期蛋白CCND2表達(dá)檢測 采用Western 印跡檢測。將以上1.8中的3組喉癌細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取、濃度測定，后續(xù)操作步驟同1.2.2。不同之處為加入一抗為CCND2 (1∶1 000， Abcam)，β-actin (1∶5 000，Abcam)為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 CAFs外泌體TEM、Western印跡及NTA鑒定 TEM檢查顯示了包膜完整、形態(tài)均一的典型外泌體形態(tài)(圖1A)。Western 印跡檢查提示2個外泌體鑒定常用陽性蛋白標(biāo)記物CD81和TSG101呈陽性表達(dá)，而外泌體鑒定常用陰性蛋白標(biāo)記物calnexin呈陰性表達(dá)(圖1B)，與文獻(xiàn)[9-10]報道一直。NTA揭示了外泌體顆粒的直徑大小分布為(112.1±55.5)nm(圖1C)，與文獻(xiàn)報道的(30～150 nm)[11]基本一致。

圖1 外泌體TEM、Western印跡及NTA鑒定 A.TEM觀察發(fā)現(xiàn)外泌體為直徑100 nm左右、包膜完整的顆粒，比例尺為500 nm；B.Western印跡檢測提示外泌體為CD81及TSG101呈陽性，而Calnexin呈陰性；C.NTA檢測提示外泌體顆粒的直徑均數(shù)約為112 nm。

2.2 CAFs外泌體miR-656-3p不同表達(dá)水平RT-PCR驗證 RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-656-3p過表達(dá)組的CAFs外泌體RNA提取物中miR-656-3p表達(dá)水平最高，而對照組、Mock組及空白對照組CAFs外泌體RNA提取物中miR-656-3p表達(dá)水平均較低，3組無明顯差異，丹參酮ⅡA作用的CAFs外泌體RNA提取物中miR-656-3p表達(dá)水平居中(圖2)。

圖2 5組CAFs外泌體中miR-656-3p 表達(dá)水平RT-PCR驗證 轉(zhuǎn)染無關(guān)干擾序列的CAFs為對照組，只添加轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的CAFs為Mock對照組，而不添加任何試劑的CAFs為空白對照組。n.s.示P＞0.05，*示P＜0.05，**示P＜0.01。

2.3 增殖及侵襲實驗 CCK8增殖實驗發(fā)現(xiàn)，CM miR-656-3p過表達(dá)組AMC-HN-8喉癌細(xì)胞的增殖能力最弱，而對照未處理組喉癌細(xì)胞的增殖能力最強，CM Tan ⅡA條件培養(yǎng)基處理組的喉癌細(xì)胞增殖能力居中(圖3A、B)。

Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，喉癌細(xì)胞穿透上室底部基質(zhì)膠到達(dá)下表面的數(shù)量從多到少依次為：未處理對照組喉癌細(xì)胞[(84.40±4.42)個，n=10]，培養(yǎng)液上室加入CM Tan ⅡA條件培養(yǎng)基處理的喉癌細(xì)胞[(55.10±2.93)個，n=10)以及培養(yǎng)液上室加入CM miR-656-3p過表達(dá)條件培養(yǎng)基的喉癌細(xì)胞[(32.00±2.27)個，n=10]。詳見圖3C～F。

圖3 CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)水平對喉癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響 A、B.3組喉癌細(xì)胞的增殖能力統(tǒng)計圖：miR-656-3p過表達(dá)條件培養(yǎng)基抑制喉癌細(xì)胞增殖能力作用最顯著，CM Tan ⅡA條件培養(yǎng)基次之；C.3組喉癌細(xì)胞的侵襲能力統(tǒng)計圖；D、E、F. 3組喉癌細(xì)胞侵襲實驗顯微鏡典型視野圖(×100)。*示P＜0.05，**示P＜0.01。

2.4 細(xì)胞周期及周期蛋白CCND2表達(dá)檢測 流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組喉癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布不同，主要區(qū)別在G0/G1期和S期的比例上。未處理組喉癌細(xì)胞G0/G1比例約為56.62%±4.07%，S期比例約為32.64%±2.64%，G2/M期比例為10.74%±1.45%；CM Tan ⅡA條件培養(yǎng)基處理的喉癌細(xì)胞G0/G1比例約為66.52%±4.06%，S期比例約為26.14%±2.63%，G2/M期比例為7.35%±1.50%；而CM miR-656-3p過表達(dá)條件培養(yǎng)基組的喉癌細(xì)胞G0/G1比例約為76.70%±4.04%，S期比例約為17.48%±2.87%，G2/M期比例為5.82%±1.17%(圖4A)。

細(xì)胞周期蛋白CCND2的Western印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCND2的表達(dá)水平由低到高依次為加入CM miR-656-3p過表達(dá)條件培養(yǎng)基的喉癌細(xì)胞、加入CM Tan ⅡA條件培養(yǎng)基處理的喉癌細(xì)胞以及未處理對照組喉癌細(xì)胞(圖4B)。

圖4 CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)水平對喉癌細(xì)胞周期分布及周期蛋白CCND2表達(dá)的影響 A.3組喉癌細(xì)胞周期分布統(tǒng)計圖：CAFs外泌體中miR-656-3p表達(dá)升高的程度與細(xì)胞周期檢測中G0/G1期細(xì)胞的比例成正相關(guān)；B.3組喉癌細(xì)胞周期蛋白CCND2表達(dá)水平Western印跡檢測：CAFs外泌體中miR-656-3p表達(dá)升高的程度與細(xì)胞周期蛋白CCND2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。n.s.示P＞0.05，*示P＜0.05，**示P＜0.01。

3 討論

CAFs外泌體miRNAs的異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生和侵襲、轉(zhuǎn)移的重要機制，目前國內(nèi)外尚未見喉癌CAFs外泌體miRNAs異常表達(dá)關(guān)鍵miRNAs的研究報道。本研究驗證了前期高通量測序所發(fā)現(xiàn)的CAFs外泌體關(guān)鍵miR-656-3p對喉癌細(xì)胞生長和侵襲能力的影響，以及中藥提取物丹參酮ⅡA通過上調(diào)CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)抑制喉癌細(xì)胞生長的功效。關(guān)于miR-656-3p在腫瘤中的研究報道文獻(xiàn)非常少，而有關(guān)外泌體miR-656-3p的報道目前尚未見，表明外泌體miR-656-3p是新發(fā)現(xiàn)的具有較大發(fā)展前景的抗癌miRNA。

外泌體的提取目前有超速離心法、沉淀法及微流控芯片法等多種方法[12]。本研究采用的是超速離心法，該方法的優(yōu)點為獲得的外泌體不被分離試劑污染，且分離數(shù)量多；缺點為樣品耗量大、耗時長。我們對超速離心法所收集的CAFs外泌體進(jìn)行了經(jīng)典的TEM、NTA和Western印跡鑒定，發(fā)現(xiàn)3項指標(biāo)均符合外泌體的典型特征(圖1)，表明所收集的為合格的外泌體樣本。

我們用基因過表達(dá)技術(shù)提高CAFs外泌體中的miR-656-3p表達(dá)水平，用RT-PCR驗證過表達(dá)效果，同時發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA作用后的CAFs外泌體中miR-656-3p表達(dá)水平也明顯升高，雖然比基因過表達(dá)的升高程度小。表明丹參酮ⅡA可能起到與過表達(dá)技術(shù)類似的效果。

進(jìn)一步用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法驗證CAFs外泌體中表達(dá)上調(diào)的miR-656-3p是否對喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲生物學(xué)特性起到抑制作用，我們發(fā)現(xiàn)miR-656-3p表達(dá)上調(diào)的CAFs外泌體加入到喉癌細(xì)胞培養(yǎng)液中之后，喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力都明顯下降，表明CAFs外泌體確實對喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力發(fā)揮了調(diào)控作用。

我們通過TargetScan、miRTarBase、miRDB及miRWalk 4個生物信息學(xué)預(yù)測軟件，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白CCND2 (cyclin D2)是miR-656-3p 4個軟件共同預(yù)測的靶基因。CCND2是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，決定細(xì)胞能否由G1期進(jìn)入S期。CCND2由290個氨基酸組成，第56～141位氨基酸為保守序列，稱為細(xì)胞周期蛋白盒，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK6(也是miR-656-3p的靶基因)相結(jié)合，形成有激酶活性的復(fù)合物并作用于抑癌基因和轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物Rb-E2F，使Rb基團磷酸化，引起E2F脫落。脫落的E2F進(jìn)一步促進(jìn)與DNA合成有關(guān)的基因表達(dá)，啟動DNA合成，進(jìn)而驅(qū)動細(xì)胞由G1期限制點進(jìn)入S期，最終推動細(xì)胞周期進(jìn)程[13-14]。調(diào)控CCND2的上游miRNAs因腫瘤而異，骨肉瘤中調(diào)控CCND2的上游miRNAs為miR-2682-3p[15]，而胰腺癌中為miR-373-3p[16]。但是，國內(nèi)外尚未見miR-656-3p對CCND2發(fā)揮調(diào)控作用的研究報道。

本研究的初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAFs外泌體中miR-656-3p表達(dá)升高的程度與細(xì)胞周期檢測中G0/G1期細(xì)胞的比例成正相關(guān)，與細(xì)胞周期蛋白CCND2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明CAFs外泌體中miR-656-3p可能是通過抑制喉癌細(xì)胞CCND2的表達(dá)從而阻斷了其從G0/G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程。

丹參酮ⅡA是常用的抗腫瘤重要成分[17-18]。文獻(xiàn)報道的主要抗腫瘤機制包括以下幾個方面：①抑制腫瘤細(xì)胞增殖，即抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期推進(jìn)，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期或促進(jìn)線粒體裂變；②誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，即通過調(diào)控BCL-2等凋亡相關(guān)基因或從線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，后者通過降低線粒體膜電位或促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放來實現(xiàn)；③抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，即調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9等細(xì)胞黏附分子的表達(dá)；④抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性，即下調(diào)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)蛋白的表達(dá)；⑤誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，即通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分化相關(guān)蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)[19]。

綜上所述，本研究在前期研究喉癌CAFs原代培養(yǎng)及外泌體miRNAs高通量測序檢測的基礎(chǔ)上揭示了以下3個關(guān)鍵問題。第一，miR-656-3p是喉癌CAFs外泌體中的關(guān)鍵miRNA。其表達(dá)的缺失顯著促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的生長，表明喉癌組織中CAFs外泌體miR-656-3p扮演的是抑癌基因的角色。第二，CAFs外泌體miR-656-3p到喉癌細(xì)胞CCND2軸是新發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤生長的關(guān)鍵通路。第三，通過基因過表達(dá)技術(shù)雖然能夠上調(diào)CAFs外泌體中miR-656-3p的表達(dá)水平進(jìn)而抑制喉癌細(xì)胞的生長和侵襲，但是基因過表達(dá)技術(shù)短期內(nèi)難以在臨床應(yīng)用。而中藥提取物丹參酮ⅡA也有類似的通過上調(diào)CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)來抑制喉癌細(xì)胞生長的作用。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 具有一定的抗腫瘤活性，但其作用機制尚不明確，尤其是通過何種機制上調(diào)CAFs外泌體miR-656-3p表達(dá)的機制；此外，本研究都是通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗來驗證的，沒有體內(nèi)成瘤實驗的驗證。這些都有待今后進(jìn)一步深入研究。